[发明专利]一种血管内皮干细胞的培养方法

摘要

一种血管内皮干细胞的培养方法，包括以下步骤：第一步、制备血管内皮干细胞；第二步、将第一步中分离的血管内皮干细胞进行培养：第三步、将第二步中获得细胞铺板进行增殖曲线实验；第四步、将第二步中获得细胞收集进行流式检测鉴定干细胞。本发明利用消化法制备了血管内皮干细胞，并建立了三种气体(氧气、氮气、二氧化碳)培养体系培养扩增血管内皮干细胞。该技术具有高效、经济、便捷等优点，可促使血管内皮干细胞增殖速度、状态较常规的二氧化碳培养法更佳。

主权项

1.一种血管内皮干细胞的培养方法，其特征在于：包括以下步骤：第一步、制备血管内皮干细胞；a、选取优质脐带，检测传染病源，传染五项指标均为阴性，则此脐带可进行下一步实验；b、分离血管内皮干细胞，包括以下步骤：①带无菌手套，取出脐带，在止血钳内侧用碘酒和酒精棉球消毒后，用无菌剪刀将两端脐带剪除；②在脐带的一端找到静脉，插入脐带静脉插管，用两根粗丝线扎牢，并冲洗静脉腔，至将脐血洗净；③赶出所述静脉腔内的残余液体，将脐带的另一端用止血钳夹闭，用10ml注射器连接针头，注入37℃预热的0.1％胶原酶约6‑8ml，放入37℃Cord Buffer中保温6‑10min；④吸出静脉腔内胶原酶所消化的细胞悬液，加入预加有20ml cord Buffer的离心管中，再冲洗静脉腔，一并加入离心管中；⑤离心，1500rpm，10min，弃上清液，收集细胞；c、配制培养液；d、培养液重悬细胞；第二步、将第一步中分离的血管内皮干细胞进行培养：a、培养血管内皮干细胞；通过充入氮气，调整O2浓度为5％、20％，CO2浓度设置为5％，将重悬的细胞进行培养；每隔3天换液，直至细胞长至80‑90％；b、细胞消化传代；步骤b所得细胞，PBS洗涤两遍后，加入消化液，放入37度培养箱消化1min，培养液重悬细胞，进行分瓶传代培养；第三步、将第二步中获得细胞铺板进行增殖曲线实验；取血管内皮干细胞，以1X103个/孔接种于六块6孔板，每两块板为一组，每板接种4孔；其中第一组置于5％CO2的条件下，第二组置于5％O2、5％CO2的条件下、第三组置于20％O2、5％CO2的条件下分别培养；培养24h后，将各板的第一孔进行消化，收集细胞，进行计数；同样，培养48h、72h、96h后分别进行同样操作，绘制增殖曲线；第四步、将第二步中获得细胞收集进行流式检测鉴定干细胞；收集P9代细胞，离心并再悬浮于1XPBS，于细胞计数仪上计数；细胞与CD45、CD34孵育；所有抗体均直接标记；培育后，收集细胞，离心并重悬于1XPBS，立即采用流式细胞仪检测。