[发明专利]一种早期胚胎组织的荧光免疫组化方法

摘要

本发明公开了一种早期胚胎组织的荧光免疫组化方法，属于动物生物技术领域。主要步骤包括胚胎清洗、固定、通透、去除内源性过氧化物酶、封闭、一抗孵育、二抗孵育及封片。本发明所采用的技术方案具有一定的针对性，主要针对早期胚胎组织，并在常规免疫组化步骤基础上进行了调整和改进。调整了组织处理方法和部分使用试剂，改变了操作方式、操作时间。本发明操作步骤简单，能有效解决实验室检验分析中一些技术问题，利于实验室规范操作，弥补了现有试验技术的不全面性，实际应用价值高。

主权项

1.一种早期胚胎组织的荧光免疫组化方法，包括以下步骤：1)溶液配制：4％多聚甲醛，0.5％Triton X‑100，20％聚乙烯吡咯烷酮储存溶液和0.1μg/mL4',6‑二脒基‑2‑苯基吲哚均用PH范围为7.2‑7.4的0.01mol/L磷酸盐溶液稀释；2)胚胎清洗：在显微镜下，将体外培育的2细胞期、4细胞期、8细胞期和16细胞期早期胚胎从培养液中捡出，用38.5℃下预热的加入6‑10％的聚乙烯吡咯烷酮的0.01mol/L磷酸盐缓冲液漂洗3次，每次5min；3)胚胎固定：用加入6‑10％的聚乙烯吡咯烷酮溶液的4％的多聚甲醛在室温下固定胚胎1h，然后用预热的加入聚乙烯吡咯烷酮溶液的磷酸盐缓冲液漂洗3次，每次5min；4)通透：用加入6‑10％的聚乙烯吡咯烷酮的0.5％Triton X‑100室温透化30min，然后用预热的加入聚乙烯吡咯烷酮溶液的磷酸盐缓冲液漂洗3次，每次5min；5)去除内源性过氧化物酶：用加入6‑10％的聚乙烯吡咯烷酮的0.01mol/L磷酸盐缓冲液配置新鲜的3％H2O2，室温封闭5‑10min，用预热的含聚乙烯吡咯烷酮的磷酸盐缓冲液漂洗3次，每次5min；6)封闭：滴血清(与二抗同一来源)孵育，37℃封闭30min；7)一抗孵育：轻轻吸除封闭液，加按抗体说明用磷酸缓冲液稀释的一抗覆盖于胚胎中，将其放在湿盒中，4℃过夜；8)二抗孵育：用预热的含6‑10％聚乙烯吡咯烷酮的磷酸盐缓冲液漂洗3次，每次5min，加按抗体说明用磷酸缓冲液稀释的荧光标记二抗，37℃中避光孵育30min；9)4',6‑二脒基‑2‑苯基吲哚染核：二抗孵育后的胚胎用含6‑10％聚乙烯吡咯烷酮的磷酸盐缓冲液漂洗3次，每次5min，取10μL 0.1μg/mL4',6‑二脒基‑2‑苯基吲哚溶液于胚胎上，室温5min；10)封片：用含6‑10％聚乙烯吡咯烷酮的磷酸盐缓冲液漂洗3次，每次5min，95％甘油封片，盖上盖玻片；11)荧光观察：在共聚焦显微镜下观察荧光分布。