[发明专利]一种胶乳增强免疫比浊法定量检测黄曲霉毒素B1的试剂

摘要

本发明之目的是提供一种胶乳增强免疫比浊法定量检测黄曲霉毒素B1的试剂，包括试剂R1、试剂R2、标准品和样本提取液；试剂R1由碳酸钠、碳酸氢钠、黄曲霉毒素B1‑载体蛋白复合物，调PH至9.5，加蒸馏水定容至1000ml制成；试剂R2由碳酸钠，碳酸氢钠，聚乙二醇，抗黄曲霉毒素B1单抗交联胶乳，牛血请白蛋白（BSA），Proclin300，调PH至9.5，加蒸馏水定容至1000ml制成；本发明组方科学合理，易生产制备，使用方便、安全、准确，可有效用于快速检测食品中的黄曲霉毒素B1，确保食品安全，经济和社会效益显著。

主权项

1.一种胶乳增强免疫比浊法定量检测黄曲霉毒素B1的试剂，其特征是：包括试剂R1、试剂R2和标准品；所述试剂R1由三羟甲基氨基甲烷（Tris）1.21‑24.23 g、黄曲霉毒素B1‑载体蛋白复合物 0.15‑1.2 g，用HCL调pH至7.4，加蒸馏水定容至1000ml制成；其中，黄曲霉毒素B1‑载体蛋白复合物的制备方法是：黄曲霉毒素B1 10mg溶于2ml甲醇，加入50μL 质量浓度为10%的H2SO4，混合物在56℃下搅拌反应4h；反应产物真空抽干，加入5ml蒸馏水，用25ml氯仿分两次提取，然后用30ml蒸馏水洗涤有机层；真空抽干去除有机溶剂，得黄色固体物；取1.0mg黄色固体物，加入4ml ，质量浓度为0.5%牛血清白蛋白（BSA）溶液（4mL 0.01M pH7.2磷酸盐缓冲液溶解20mg BSA），37℃反应30min；加入150μL 6.5mmol/L NaHB4 ，4℃反应30min；加入100μL 浓度为0.1M的 HCl，除去过量的NaHB4；4℃反应48小时，反应完成后，置于浓度0.01M ,pH7.2 磷酸盐缓冲液(PBS)中透析48小时，每4h换PBS溶液一次，除去未反应的固体物，即为黄曲霉毒素B1‑牛血清白蛋白复合物；所述的试剂R2由三羟甲基氨基甲烷（Tris）1.21‑24.23 g，聚乙二醇6000 10‑30 g，抗黄曲霉毒素B1单抗交联胶乳80‑500mg，牛血清白蛋白（BSA）10‑30 g，Proclin300 1‑5ml混匀，用HCL调PH至7.4，加蒸馏水定容至1000ml制成；其中，抗黄曲霉毒素B1单抗交联胶乳的制备方法是：(l)活化羧基：称取羧基胶乳颗粒30‑200mg，胶乳颗粒直径50‑500nm，溶于pH6.5,50mM 10ml 2‑吗啉乙磺酸（MES）中，成乳胶溶液；称取交联剂1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）30mg、N‑羟基琥珀酰亚胺（NHS）30mg依次加入上述胶乳溶液中，震荡活化反应1h，成活化胶乳颗粒，在22000rpm下离心40分钟，弃去上清液，沉淀用pH6.5,浓度50mM的 2‑吗啉乙磺酸（MES）10ml复溶，重复离心二次；沉淀溶于10ml 0.01M pH7.2 磷酸缓冲盐溶液（PBS）中，成活化胶乳；(2)活化胶乳每毫升中加入500μg黄曲霉毒素B1单克隆抗体，室温搅拌下反应4小时，得反应液，随后每毫升反应液加入质量浓度为10%的牛血清白蛋白（BSA）溶液500μl，继续室温搅拌反应2小时 ；20000rpm下离心40分钟；去上清液，沉淀用0.01M ,pH7.4 Tris‑HCL缓冲液复溶，即成抗黄曲霉毒素B1单抗交联胶乳；所述标准品制备方法：（1）pH 7.4 0.01M磷酸盐缓冲溶液（PBS）的配制：分别称取磷酸氢二钠1.44g，磷酸二氢钾 0.24g，氯化钠8 g，氯化钾0.2g，用蒸馏水溶解、混匀，定容至1000ml，调pH值至7.4，备用；（2）标准品的配制：将纯度99.8%的黄曲霉毒素B1 1mg，用甲醇完全溶解后，定容至浓度100μg/ml；取10μL 浓度为100μg/ml黄曲霉毒素B1标准品，用0.01M ,pH7.4磷酸盐缓冲溶液（PBS）定容至浓度100ng/ml；取2.5mL 浓度100ng/ml黄曲霉毒素B1溶液，用pH7.4浓度为0.01M磷酸盐缓冲溶液（PBS）定容至浓度为2.5ng/ml的标准品。