[发明专利]一种基于过氧化氢酶活性的用于检测胶基型嚼烟对细胞氧化性损伤的方法

摘要

本发明涉及一种基于过氧化氢酶活性的用于检测胶基型嚼烟对细胞氧化性损伤的方法，属于烟草及烟草制品生物学效应评价技术领域。该方法包括样品前处理、单细胞悬液的制备、单细胞悬浮液的细胞浓度计算、受试物暴露、收集细胞、样品制备、标准曲线测定、样品测定、蛋白浓度测定和过氧化氢酶酶活性计算计算十一大步骤。本发明综合考察胶基型嚼烟样品的溶出方式、暴露途径、作用方式，建立了胶基型嚼烟样品前处理方法，样品的有效处理、检测剂量的优化设定以及靶细胞的正确选择，使得本方法能够准确有效的检测胶基型嚼烟对细胞氧化性损伤。

主权项

1.一种基于过氧化氢酶活性的用于检测胶基型嚼烟对细胞氧化性损伤的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤（1），样品前处理：将胶基型嚼烟制品加入到37℃的口腔角质细胞培养基中，胶基型嚼烟制品的质量与口腔角质细胞培养基的体积比为1g：10mL；之后于37℃下研磨10min，之后过滤，向滤液中加入血清，使得血清的最终体积百分浓度为10%，得到待测液；步骤（2），单细胞悬液的制备：将人口腔角质细胞HOK于37℃、5%CO2培养箱中采用口腔角质细胞培养基培养，待细胞汇合率为80～90%时移除培养基，用pH值为7.2的磷酸缓冲液洗两次，弃洗液；加入浓度为0.25%（w/v）的胰蛋白酶溶液进行单层孵育1～2min，每25cm2生长面积的细胞需要加入浓度为0.25%（w/v）的胰蛋白酶溶液1～2mL，单层孵育后再加入口腔角质细胞培养基将细胞悬起，得到单细胞悬浮液；步骤（3），单细胞悬浮液的细胞浓度计算：用血球计数板计数法对步骤（2）所得单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，计算出每毫升单细胞悬浮液的活细胞数；步骤（4），细胞接种：将步骤（3）计数后的单细胞悬浮液用口腔角质细胞培养基稀释至2.0×105个/mL，再按接种量为4mL/皿接种到细胞培养皿中，之后将细胞培养皿置于37℃、5%CO2培养箱内培养24h；步骤（5），受试物暴露：受试物分为两组：细胞对照组和样品测试组；移除步骤（4）中细胞培养皿内的培养基，再按上述方法进行分组；在细胞对照组相应的皿内加入口腔角质细胞培养基；在样品测试组相应的皿内加入口腔角质细胞培养基和步骤（1）所得待测液，至待测液的体积百分浓度分别为10%、20%、30%、40%、50%；细胞对照组和样品测试组的终体积为6mL/皿；之后置于37℃、5%CO2培养箱中孵育24h；步骤（6），收集细胞：每皿分别收集细胞，具体的收集方式为：去除培养基，加入PBS 4mL，浸泡30s后去除PBS，加入1mL 0.25%（w/v）的胰蛋白酶溶液单层孵育1～2min，用口腔角质细胞培养基悬起，4℃离心，弃上清液，收集细胞；步骤（7），样品制备：将步骤（6）每皿收集得到的细胞，加入100μl细胞裂解液在冰浴环境下对细胞进行裂解，裂解后，4℃离心，取上清液，作为待测样品；步骤（8），标准曲线测定：取0、12.5、25、50、75μl 配制好的5mM过氧化氢溶液，分别加入过氧化氢酶检测缓冲液稀释至最后体积为100μl，混匀，得到不同浓度的标准品稀释液；各取不同浓度的标准品稀释液4μl加入细胞培养板的孔中，各孔分别加入200μl显色液，25℃孵育至少15min后，于520nm测定吸光度，得到标准品的A520；步骤（9），样品测定：将步骤（7）每皿得到的上清液分别取40μl置于不同的离心管中，同时，另外设置空白对照离心管，空白对照离心管中加入40μl过氧化氢酶检测缓冲液，接着，向所有的离心管中均加入10μl 250mM过氧化氢溶液，混匀后，25℃反应5min，再向所有的离心管中加入450μl过氧化氢酶反应终止液振荡混匀以终止反应，得到反应液；将各离心管中的反应液取10μl分别与30μl过氧化氢酶检测缓冲液混匀，得到其最终反应体系液体，之后，取最终反应体系液体10μl加入细胞培养板的孔中，再各孔分别加入200μl显色液，于25℃孵育15min后，于520nm测定吸光度，得到空白对照的A520和各待测样品的A520；步骤（10），蛋白浓度测定：根据蛋白浓度测定试剂盒操作步骤测定步骤（7）每孔得到的上清液的蛋白浓度；步骤（11），过氧化氢酶酶活性计算：a.将步骤（8）测定的标准品稀释液的吸光度值作为y，相应的标准品稀释液的浓度作为x绘制标准曲线；b.将空白对照的A520和各待测样品的A520带入所得到的标注曲线中，计算出待测样品和空白对照中残余的过氧化氢浓度；c.过氧化氢酶酶活性通过下式计算：[待测样品过氧化氢酶酶活性]＝（[空白对照残余过氧化氢浓度]－[待测样品残余过氧化氢浓度]）×5/（5min×40μl×[蛋白浓度]），由此得到细胞对照组和样品测试组的过氧化氢酶酶活性；之后，将样品测试组的过氧化氢酶酶活性与细胞对照组的过氧化氢酶酶活性相比，如有显著差异，且样品测试组的剂量与样品测试组的过氧化氢酶酶活性相比，有剂量反应关系的，即为阳性结果，该胶基型嚼烟会引起细胞氧化性损伤；将样品测试组的过氧化氢酶酶活性与细胞对照组的过氧化氢酶酶活性相比，如无显著差异，且样品测试组的剂量与样品测试组的过氧化氢酶酶活性相比，无剂量反应关系的，则为阴性结果，该胶基型嚼烟不会引起细胞氧化性损伤。