[发明专利]一种RNA病毒基因组的定点改造方法

摘要

本发明涉及生物科技技术领域，尤其是一种RNA病毒基因组的定点改造方法，包括以下步骤：S1、构建定点切割的核酸酶系统：构建至少一个包含导向功能的分子和具有定点切割RNA活性的蛋白核酸酶系统；S2、构建包含有特异性突变、缺失或插入序列的同源序列；S3、构建病变细胞；S4、转染细胞；S5、收集子代病毒收获液；S6、分离出子代病毒。本发明能够高效的实现RNA病毒基因组的定点改造,并能够快速方便地筛选获得具有特定突变类型的重组病毒。

主权项

1.一种RNA病毒基因组的定点改造方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、构建定点切割的核酸酶系统：构建至少一个包含导向功能的分子和具有定点切割RNA活性的蛋白核酸酶系统；S2、构建包含有特异性突变、缺失或插入序列的同源序列；S3、构建病变细胞：A1、细胞的培养：选取水解酪蛋白琼脂灭菌处理后，水解酪蛋白琼脂是由重量百分比为5-25％牛肉浸汁粉，40-60％水解酪蛋白，2-16％的淀粉，15-36％的琼脂混合后加入蒸馏水水解而成，与人红细胞液按体积比为8-22∶1混合均匀，得到细胞培养液；A2、在盛放有细胞培养液的培养板中加入病毒液，吸附，然后吸去病毒液，培育至细胞完全病变，得到病变细胞；S4、转染细胞：收集上一步的病变细胞，使用S1和S2得到核酸酶系统和同源序列共同转染细胞，得到转染细胞，其中，控制细胞数量与表达核酸酶系统的质量之间的比例为1×105:0.5-3μg；S5、收集上一步得到的病变细胞和/或上清，冻融或超声处理后，离心去除细胞碎片，所得上清即为子代病毒收获液；S6、从上一步得到的子代病毒收获液中，挑取来源于单克隆的子代病毒，通过核酸测序鉴定，分离出子代病毒；完成RNA病毒基因组的定点改造。