[发明专利]一种用于提高青花菜游离小孢子培养胚胎发生率及成苗率的方法

摘要

本发明提供了一种用于提高青花菜游离小孢子培养胚胎发生率及成苗率的方法，以解决现有技术中小孢子胚胎发生率低、直接成苗率低、培养周期长的问题。通过向诱导培养基NLN中添加噻苯隆(thidiazuron，TDZ)，以提高青花菜小孢子胚胎发生率和成苗率。在添加0.05～0.45mg/L的TDZ的NLN诱导培养基中，胚胎发生率提高了1.6～2.2倍，胚胎的成苗率提高了1.5～1.6倍。

主权项

一种用于提高青花菜游离小孢子培养胚胎发生率及成苗率的方法，其特征在于：包括如下步骤：首先，选取花蕾长度在2～4cm之间的无裂蕾、虫蕾和病蕾的健康花蕾，流水冲洗3min，将挑选后的花蕾放入灭过菌的大烧杯内，依次经过30s的75％乙醇溶液、6～8min的0.1％HgCl2溶液、3次5min的无菌水消毒、灭菌和洗涤。再加入10～15mL含130g/L蔗糖的B5液体培养基，用无菌研棒挤压花蕾，使小孢子游离出来。将含有小孢子的悬浮液先用300目细胞筛过滤，再用40μm与50mL离心管配套的细胞筛过滤，收集滤液于50mL离心管中，1000～1200rpm离心3min。弃上清液，重复2次，所得沉淀物即为纯净的小孢子；其次，将游离出的纯净小孢子沉淀物用含TDZ浓度为0.05～0.45mg/L的NLN培养基进行稀释培养。在稀释时使细胞密度保持在1×105～2×105个/mL(用血球计数板计数)，将每5mL小孢子悬浮液分装入为90mm×15mm的一次性塑料培养皿内，每皿添加浓度为5g/L的灭菌后的活性炭溶液100μL，用石蜡膜封口后，先在33℃恒温箱中热激处理1d，再转至25℃下静置暗培养，至肉眼可见胚状体后，再转移到摇床上(50rpm)继续暗培养。21d后统计胚状体数目，小孢子胚诱导率以每个花蕾产生胚状体数表示。在接种小孢子25d后转接胚状体到添加30g/L蔗糖，7.5g/L琼脂，0.1～0.3mg/L TDZ，0.1g/L活性炭的MS培养基上，培养基pH为5.8～6.0，高温湿热灭菌；接种量为每100mL广口三角瓶含50mL培养基接种3～5个胚状体。于25±1℃，16h光照/天条件下培养，25～30d后胚状体发育为根、茎、叶明显健壮的小苗；形成次生胚、愈伤组织和发育畸形的胚状体转接到同样的培养基上，使其继续发育成苗。