[发明专利]一种草鱼垂体细胞体外培养方法

摘要

本发明一种草鱼垂体细胞体外培养方法，本发明采用的草鱼垂体细胞原代培养方法可重复性强，并且细胞很好的保持了草鱼垂体的原始功能，另外采用自己配制的培养基和草鱼血清替代商品化的液态培养基和胎牛血清，可以极大降低培养成本，适宜大规模培养，为研究鱼类垂体功能和神经内分泌学提供了细胞模型。

主权项

一种草鱼垂体细胞体外培养方法，包括下述步骤：（一）草鱼垂体细胞分离（1）健康新鲜草鱼垂体使用WM培养基清洗后，将垂体切成0.5~0.8mm的小块，WM培养基再次清洗去除血块和杂质；（2）取50‑100mg胰蛋白酶溶解于10ml WM培养基中，将垂体小块置于胰蛋白酶溶液中，20‑37°C水浴锅中消解；（3）吸去含有胰蛋白酶的WM培养基，加入含有2.0‑5.0mg/ml胰蛋白酶抑制剂的WM培养基，室温静置中和未去除的胰蛋白酶；（4）吸去含有胰蛋白酶抑制剂的WM培养基，加入含有0.1‑0.5mg/mlDNaseII的WM培养基，室温静置以消解细胞间的DNA连接；（5）吸去含有DNase II的WM培养基，加入含有1.5~3.0mM EDTA的CM培养基摇晃或是静置后将培养基吸走；（6）将垂体碎片转移到新的离心管中，向管中加入CM培养基，使用吸管轻轻吹打垂体碎片，细胞被吹散，此时将上层细胞使用40‑100 μm孔径的细胞筛过滤后收集到离心管中；（7）对收集的细胞溶液，使用500‑2000rpm常温下离心5‑20分钟收集细胞；（8）使用PM培养基对细胞进行重悬并镜检；（二）草鱼垂体细胞培养（9）用PM培养基稀释细胞接种至细胞培养板；优选的，每孔接种2.5×106个垂体细胞；（10）将接种好的细胞置于细胞培养箱中培养，待细胞贴在细胞培养板底部，向每个孔中加入含有草鱼血清的PM培养基，使每孔中的草鱼血清终浓度为5‑10%，置于细胞培养箱继续培养；（11）垂体细胞在含有5‑10 %草鱼血清的PM培养基中培养贴壁后，将培养基吸去，加入：A. 含有5‑15 ng/ml碱性成纤维生长因子的NM培养基进行传代培养；或B. 加入TM培养基培养后进行后续加药实验；所述的 WM培养基配方包括：MEM: 5.0‑10.0mg/ml, HEPES: 5.0‑10.0mg/ml, NaHCO3: 2.0‑5.0mg/ml, BSA: 2.0‑5.0mg/ml, 青霉素: 50‑100 U/ml，链霉素：50‑100 μg/ml，其余为双蒸水；所述的CM培养基配方包括：M199: 5.0‑10.0 mg/ml, HEPES: 5.0‑10.0 mg/ml, NaHCO3: 2.0‑5.0 mg/ml,青霉素: 50‑100 U/ml，链霉素：50‑100 μg/ml，其余为双蒸水；所述的PM培养基配方包括:MEM: 5.0‑10.0 mg/ml, NaHCO3: 2.0‑5.0 mg/ml, HEPES: 5.0‑10.0 mg/ml, 青霉素: 50‑100 U/ml，链霉素：50‑100 μg/ml，其余为双蒸水；所述的TM培养基配方包括:MEM: 5.0‑10.0 mg/ml, NaHCO3: 2.0‑5.0 mg/ml, HEPES: 5.0‑10.0 mg/ml, BSA: 1.0‑3.0 mg/ml, 青霉素: 50‑100 U/ml，链霉素：50‑100 μg/ml，其余为双蒸水；所述的NM培养基的配方包括：MEM:10.0‑12.0 mg/ml, NaHCO3:2.0‑3.0 mg/ml, HEPES: 6.0‑8.0mg/ml, 青霉素: 100‑200 U/ml，链霉素：100‑200 μg/ml，GlutaMax Supplement: 25‑50μM，B27 Supplement (50×): 2‑5%，FBS: 5‑10%。