[发明专利]一种检测电子烟气溶胶水提物对细胞周期影响的方法

摘要

本发明公开了一种检测电子烟气溶胶水提物对细胞周期影响的方法。包括样品前处理、单细胞悬浮液制备、细胞浓度计算、细胞接种、受试物暴露、收集细胞、细胞固定、染色和流式检测与分析等步骤。本发明综合考察了电子烟制品的使用特点和作用方式，建立了全新的样品前处理方法，选取人肺成纤维细胞HPF作为试验检测用细胞，并确定了样品检测剂量。样品的有效处理、检测剂量的优化设定以及靶细胞的正确选择，使得本发明方法能够准确有效地检测电子烟气溶胶水提物对细胞周期的影响，为电子烟的安全性评估提供技术支持。

主权项

一种检测电子烟气溶胶水提物对细胞周期影响的方法，具体为以下步骤：(1)样品前处理：采用直线型吸烟机，在抽吸容量为55.0ml，持续时间3s，抽吸频率30s的条件下，连续抽吸100口电子烟，用装有FM细胞培养基的捕集瓶捕集电子烟烟雾，捕集浓度为20口/mL，捕集液用0.22μm无菌过滤器过滤除菌，得到电子烟烟雾的气溶胶水提物作为待测液，‑80℃保存待用；(2)单细胞悬浮液的制备：人肺成纤维细胞HPF复苏后，接种到25cm2细胞培养瓶中,加入10mL FM细胞培养基，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，倒置显微镜观察培养细胞的汇合和形态情况，待细胞长至70％～90％的汇合率时，移除培养瓶中的FM细胞培养基，用磷酸缓冲液洗两次，弃洗液；加入1mL 0.25％(w/v)的胰蛋白酶溶液单层孵育1～2min，用FM细胞培养基悬起，形成单细胞悬浮液；(3)单细胞悬浮液的细胞浓度计算：用血球计数板计数法对所得单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，得到每毫升单细胞悬浮液的活细胞数；(4)细胞接种：将计数后的单细胞悬浮液用FM细胞培养基稀释至2.0×105个/mL，再按接种量为2mL/孔接种到6孔细胞培养板中，然后将6孔细胞培养板置于37℃、5％CO2培养箱内培养24h；(5)受试物暴露取出6孔细胞培养板，去除细胞培养液，按照表1将不同剂量的待测液加入细胞培养板中，每个剂量设3个复孔，置于37℃，5％CO2培养箱中培养24h；表1 细胞周期检测加样表(6)收集细胞取出细胞培养板，将同一培养孔中的细胞培养液和消化后的细胞收集到同一个15ml离心管中，不同培养孔分开收集，1000r/min转速下离心5分钟，弃上清；(7)细胞固定：在每支离心管中加入1ml、4℃预冷的70％的乙醇，轻轻吹打均匀，4℃固定2h；1000r/min转速下离心5分钟，弃上清，加入500μl、4℃预冷的PBS缓冲液，重悬细胞，1000r/min转速下再次离心5分钟，弃上清，获得细胞；(8)染色：在每支离心管中加入200μl用PBS配制的染液，避光染色30min，染液中RNase酶的浓度为1mg/ml，碘化丙啶染料的浓度为50μg/ml；(9)流式检测和分析：用流式细胞仪在激发波长488nm波长处检测，进行DNA含量分析。