[发明专利]一种纸基双模式检测铅离子的方法

摘要

本发明公开了一种纸基双模式检测铅离子的方法。利用蜡打印和激光切割技术在纸上制备疏水区域和亲水区域，并借助丝网印刷技术，印制三电极。通过多种方法对纸芯片的不同区域进行功能化，利用3,3’,5,5’‑四甲基联苯胺的显色作用可以实现对铅离子的可视化预判。利用铅离子和DNA酶的特异性识别作用以及葡萄糖氧化酶对葡萄糖的特异性催化，借助电化学工作站可以实现对待测物的超灵敏检测。

主权项

1.一种纸基双模式检测铅离子的方法，其特征是包括以下步骤：(1) 在计算机上利用Adobe Illustrator CS4软件设计一个十字形疏水蜡打印图案并利用喷蜡打印机将其批量打印到裁剪的A4尺寸滤纸上，随后将其在加热板加热至蜡融化并渗透整个纸的厚度，形成疏水墙，借助折纸技术构筑纸器件；该纸器件包含4部分，分别为通道板、检测板、参比板和遮光板，各板之间预留有空白区域以供折叠，其中检测板上印有圆形亲水工作区域和矩形亲水比色条，通道板用来辅助液体流动，使得检测板工作区域的液体流动到比色条以实现可视化预判，遮光板用来防止外部光源对可视化反应的干扰，检测板与参比板结合用于对目标物的精准检测；(2) 采用丝网印刷的方法，将碳工作电极印刷到检测板，Ag/AgCl参比电极和碳对电极印刷到参比板，将通道板中疏水蜡包围的圆形亲水区域居中进行打孔，孔直径比圆形区域直径小1 mm；将疏水蜡包围的纵向矩形亲水区域居中进行切割，宽度比矩形区域的宽度小0.5 mm；(3) 在参比板的矩形连接端口背面通过种子溶液生长法生长花状金纳米粒子，具体生长步骤为：首先将80 mL 二次水加热至90℃，并加入0.8 mL质量分数为 1% 的氯金酸溶液，继续加热至96 ℃保持1 min，最后加入2.8 mL 质量分数为1%的柠檬酸钠，并加热8 min得到金种子溶液，取20 μL得到的金种子溶液滴加在矩形连接端口背面，静置晾干，重复三次；将100 μL 200 mmol/L的抗坏血酸和100 μL 质量分数为1%的氯金酸溶液混合，取20 μL混合溶液滴加到修饰有金种子的矩形连接端口背面，静置30 min，用二次水冲洗3次；(4) 对检测板的圆形亲水工作区域进行功能化，首先通过种子溶液生长法生长花状金纳米粒子，步骤参考(3)；其次，取20 μL由30 μL 1 μmol/mL DNA链P1, 500 μL 1 mmol/L三(2‑羧乙基)膦和500 μL pH 8.0的三（羟甲基）氨基甲烷缓冲溶液组成的混合溶液滴加到金纳米粒子修饰的工作区域，自然晾干后继续滴加20 μL 1 mmol/L的巯基己醇封闭液，用10 mmol/L pH 8.0的三（羟甲基）氨基甲烷缓冲溶液多次冲洗工作区域并自然晾干，所述的DNA链P1碱基序列如核苷酸序列表所示，其中其5’端修饰有1个巯基和6个亚甲基；(5) 在检测板圆形亲水工作区域修饰DNA链P2/还原氧化石墨烯/PdAu纳米粒子/葡萄糖氧化酶纳米复合物，具体步骤为：称取105 mg聚乙烯吡咯烷酮，300 mg 溴化钾，57 mg 氯钯酸钠分散于10 mL 二次水中，使其完全溶解；将上述得到的混合溶液置于80 ℃油浴锅中磁力搅拌作用下反应3小时，冷却至室温，用乙醇和二次水洗涤除去多余的溴离子，得到Pd种子溶液；将由1.0 mL 上述Pd种子溶液，5.0 mL二次水，5 mg 聚乙烯吡咯烷酮，3.0 mg 抗坏血酸组成的混合溶液置于20 mL圆底烧瓶中，在95 ℃油浴锅中磁力搅拌作用下反应20 min，用移液枪取268 μL 24.3 mmol/L的氯金酸溶液加入圆底烧瓶，继续于95 ℃下加热15 min，冷却至室温，用乙醇和二次水洗涤数次得到PdAu纳米粒子，4 ℃保存；将由2.5 mL 2.0 mg/mL氧化石墨烯溶液，7.5 mL二次水，10 mL聚乙烯亚胺，100 μL 氨水组成的混合溶液于室温磁力搅拌作用下反应30 min后加热至60 ℃反应12小时，加入300 μL PdAu纳米粒子并于60 ℃环境下反应12小时，将所得溶液用乙醇和二次水洗涤数次得到还原氧化石墨烯/PdAu复合物；将由1.0 mL 1.0 mg/mL 还原氧化石墨烯/PdAu复合物, 1.0 mL 100 µg/mL 葡萄糖氧化酶组成的混合溶液在磁力搅拌作用下反应2小时，加入5.0 mL 封闭液超声处理2小时，用乙醇和二次水洗涤数次，得到还原氧化石墨烯/PdAu/葡萄糖氧化酶纳米复合物；最后，取1.5 µL 10 mmol/L 的三(2‑羧乙基)膦和1.0 µL 0.1 M 的pH 5.2的三（羟甲基）氨基甲烷缓冲溶液滴加到10 µL 10 mmol/L DNA链P2中反应2小时，继续向其中加入 1.0 mL 还原氧化石墨烯/PdAu纳米粒子/葡萄糖氧化酶纳米复合物于磁力搅拌作用下反应16小时，将所得溶液加入到250 µL 100 mmol/L氯化钠溶液和250 µL pH 8.0的三（羟甲基）氨基甲烷缓冲溶液中反应24 小时，经过数次离心洗涤得到DNA链P2/还原氧化石墨烯/PdAu纳米粒子/葡萄糖氧化酶纳米复合物，所述的DNA链P2碱基序列如核苷酸序列表所示，其中其5’端修饰有1个巯基和6个亚甲基，且自左向右第十个碱基A代表腺嘌呤核糖核酸；(6) 在步骤(4)的基础上继续对检测板的圆形亲水工作区域进行功能化，取20 μL步骤(5)得到的DNA链P2/还原氧化石墨烯/PdAu纳米粒子/葡萄糖氧化酶纳米复合物滴加到检测板圆形亲水工作区域，并于37 ℃环境反应2小时，将此工作区域浸入10 mmol/L pH 8.0的三（羟甲基）氨基甲烷缓冲溶液中5‑10分钟以减少非特异性吸附；(7) 取20 μL 20 mmol/L 3,3’,5,5’‑四甲基联苯胺和10 μL 5mmol/L H₂O₂滴加到检测板矩形亲水比色条，并自然晾干；取20 μL含有铅离子的待测溶液滴加于检测板的圆形亲水工作区域反应30 min，将通道板沿预留空白区域对折于检测板上部，取40 μL pH 8.0的三（羟甲基）氨基甲烷缓冲溶液滴加到检测板的圆形亲水工作区域，液体通过通道板的亲水通道流入检测板的比色条，10秒后将比色条置于颜色采集窗口，读取颜色灰度值；(8) 将参比板沿预留空白区域对折于检测板下部，取0.36 g葡萄糖和0.012 g鲁米诺加入到40 mL pH 8.0的三（羟甲基）氨基甲烷缓冲溶液，完全溶解后取20μL所得溶液滴加到检测板的圆形亲水工作区域中，将此纸基双模式设备连接到电化学工作站精准检测铅离子浓度；(9) 分别绘制电化学发光强度和灰度与铅离子浓度的标准曲线，完成铅离子的双模式测定。