[发明专利]一种高效基因编辑快速制备PD-1ˉT细胞方法及其应用

摘要

本发明公开了一种获得PD‑1‑T细胞的方法，包括以下步骤：（1）获取人外周血T淋巴细胞；（2）质粒转染；（3）融合细胞的制备；（4）PD‑1‑T肿瘤特异性T细胞的扩增。本发明还公开了该获得PD‑1‑T细胞的方法的应用，利用本发明方法获得的PD‑1‑T细胞排除了负抑制性调节受体，具有很好的抗肿瘤效应，相比传统过继治疗的细胞有效延长了荷瘤小鼠的生存时间，适合医学领域的推广。

主权项

一种高效基因编辑快速制备PD‑1ˉT细胞方法，其特征在于，包括以下步骤：1）获取人外周血T淋巴细胞：取外周血100ml，用等量PBS稀释血液后缓慢加入淋巴细胞分离液，离心，弃血清，将白膜层中单个核细胞吸出于新的离心管中，离心，弃上清，用15~30mlPBS洗三次；用不完全1640重悬置于培养箱中，1.5~2.5h细胞贴壁后，吸取悬浮的细胞，过尼龙绵柱后得到T淋巴细胞；2）质粒转染：将步骤1）所得T淋巴细胞调整浓度为1×10⁷/ml，质粒调整为相同浓度，分别吸取90~120μl细胞悬液、2~5μl质粒与2~10μl高穿透力小分子引导肽TAT水溶液均匀混合后吸入无菌的电转杯，电转后快速将细胞转移至12孔板中并加入2ml预热的完全培养基，置于37℃，5%CO₂培养箱继续培养，即可完成质粒转染，得到PD‑1ˉT细胞；3）融合细胞的制备：向步骤1）中的贴壁细胞中加入GM‑CSF1000M/ml、IL‑4500M/ml诱导出DC细胞，然后靶细胞HepG2，使用分子量为1450的PEG诱导DC/HepG2融合；4）PD‑1ˉ肿瘤特异性T细胞的扩增：使用步骤3）所得DC/HepG2融合诱导步骤（2）中完成质粒转染的PD‑1ˉT细胞增殖。