[发明专利]在线监测用葡萄糖氧化酶丝网印刷电极及其制备方法

摘要

本发明提供了在线监测用葡萄糖氧化酶丝网印刷电极及其制备方法。该电极以化学沉积法制备的普鲁士蓝掺杂的碳基丝网印刷电极为电化学换能器件，修饰以固定化的葡萄糖氧化酶层形成酶生物传感器。该电极可有效避免发酵液中复杂成分带来的干扰，具有可重复使用、信号重现性好的特点，因而能够满足常规发酵在线分析的要求。本发明采用丝网印刷工艺进行化学修饰电极的制作，以提高其重现性并使该电极能够用于批量生产。此外，本发明所使用的酶固定化方法简单，使用纤维素滤纸、玻璃纤维素滤纸等简单材料即可达到有效限制酶制剂流失的目的，适合批量生产酶电极的修饰并有足够长的酶活力寿命。

主权项

1.一种在线监测用葡萄糖氧化酶丝网印刷电极，其特征在于，由以下方法制备而成：1）普鲁士蓝掺杂的介体型过氧化氢丝网印刷电极制作：配制含等摩尔浓度K₃Fe(CN)₆和KCl的水溶液，以盐酸调节其pH在1.0‑2.5范围内，在快速搅拌条件下向其中逐滴加入1‑1.33倍体积含等摩尔浓度的FeCl₃水溶液，充分反应后以4000 rpm离心分离获得深蓝色物质即普鲁士蓝；置于烘箱内于95℃烘干至恒重，再于同一烘箱内于100℃‑150℃下烘制0.5‑2h，得到活化的普鲁士蓝，干燥器内冷却后以研钵研细成颗粒待用；称取普鲁士蓝颗粒0.05g，配和入1mL N,N‑二甲基甲酰胺以研钵研细，随后加入3g导电碳浆 和2mL导电碳浆专用溶剂精细研磨20min使物料充分混匀，制成普鲁士蓝掺杂的碳基导电油墨；取厚度为0.5 mm的聚氯乙烯基片，以1 mol/L NaOH溶液浸泡处理4 h后洗净晾干；制作普鲁士蓝掺杂丝网印刷电极：（1）首先，在洗净的聚氯乙烯基片上以导电碳浆印制导线及两个电极，印刷完成后，置于90℃的烘箱内使有机溶剂充分挥发；（2）两个电极中取其中一个作为对电极，另一个电极上印制普鲁士蓝掺杂的碳基导电油墨成工作电极，印刷完成后，置于90℃的烘箱内使有机溶剂充分挥发并使基底电极得到活化；（3）最后以环氧树脂印制环氧树脂绝缘层，覆盖其导电部分，仅暴露出其工作面积、对电极及同检测器连接的导电部；印刷完成后，置于90℃的烘箱内使有机溶剂充分挥发；2）酶固定化载体制备以含有0.1 mol/L冰乙酸的水溶液在90℃条件下溶解固体聚乙烯亚胺PEI获得质量浓度为1.0‑2.0 wt%的聚乙烯亚胺水溶液，冷却后过滤得纯净的聚乙烯亚胺溶胶；取1.0‑2.0 wt%聚乙烯亚胺溶胶，在磁力搅拌条件下逐滴滴加入含量为20‑500倍聚乙烯亚胺干重的戊二醛GA水溶液中进行充分反应，所用戊二醛为质量分数为25%‑50%的水溶液，反应时间为12‑16h得到PEI‑GA合成母液；为去除PEI‑GA合成母液内的戊二醛以获得纯净的PEI‑GA，使用截留分子量为8‑50 kDa的透析袋进行2‑3d的透析，其间每隔4‑6h更换一次透析液，所用透析液为0.01‑0.1 mol/L的Na₂Ac‑HAc缓冲液；或以乙醚或三氯甲烷为萃取剂对合成母液进行反复透析后，与萃取产物等体积的0.01‑0.1 mol/L的Na₂Ac‑HAc缓冲液混合；或以截留分子量为3‑50 kDa的超滤膜进行超滤；3）固定化葡萄糖氧化酶PEI‑GA‑GOx的制备及酶电极的制作（1）取2.5‑3份体积的纯化PEI‑GA以0.01‑0.1 mol/L的Na₂Ac‑HAc缓冲液稀释成PEI‑GA含量为0.1‑0.5wt%的稀溶液；（2）以0.01‑0.1 mol/L的Na₂Ac‑HAc缓冲液配制含300‑340 U/mL的GOx酶稀释液，取0.8‑1份与步骤（1）所述的溶液均匀混合并静置0‑30 min，于4℃、2000‑6000 rpm条件下离心5‑10 min，收集其沉淀部分待用；（3）将沉淀部分以5‑6份体积0.01‑0.1 mol/L Na₂Ac‑HAc的缓冲液重新分散，再将分散液同1.7‑3.4份体积0.01‑0.1 mol/L Na₂Ac‑HAc缓冲液配置的含1‑3 wt%的羧基化聚乙烯亚胺、羧甲基纤维素钠、牛血清蛋白或其混合物均匀混合，静置0‑30 min后所得悬浊液即经固定化修饰后的酶制剂；（4）将25‑50 μL该悬浊液滴加于介体掺杂的丝网印刷电极片工作面积上成固定化酶层，于室温条件下静置3‑4小时；以切割成合适尺寸的纤维素滤纸或玻璃纤维素滤纸为保护膜紧密覆盖电极片的工作面积，以双面胶密封后成为成品酶电极。