[发明专利]一种卵母细胞中蛋白的检测方法

摘要

本发明属于蛋白检测领域，具体涉及一种卵母细胞中蛋白的检测方法，包括如下步骤：S1，蛋白样的提取；S2，SDS‑PAGE凝胶电泳流程；S3，转膜；S4，封闭；S5，孵育一抗；S6，孵育二抗；S7，显影。所述蛋白样的提取过程中添加玻璃珠用于充分提取蛋白的方法以及显影过程中自封袋的巧妙运用。相比以往的技术方法，本方法在卵母细胞样的处理方式和显影环节的优化方面实施了创造性的发明和改进，因此显著提高了蛋白检测的效率。本方法通过少量试验材料就能检测低丰度蛋白的方案，检测内参蛋白只需要1个卵母细胞就能测出条带，对于表达丰度较低的蛋白质需要40个左右就能出较清晰的条带，相比现有技术需要不低于200个卵母细胞，效率显著提高。

主权项

一种卵母细胞中蛋白的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：S1，蛋白样的提取，在4℃预冷的离心管A中配制裂解液，所述裂解液包括WB及IP细胞裂解液、1mmol/L的PMSF，所述WB及IP细胞裂解液、1mmol/L的PMSF的体积比为9:1，取10μl配制好的裂解液加入离心管B中，将4℃预冷的直径为425‑600um，数量为10‑20个的玻璃珠加入离心管B中，将胚胎在4℃预冷的DPBS中清洗3遍后移入离心管B中，漩涡震荡仪以2500rpm震荡30s，重复3次，然后离心，离心条件为4℃、10000‑14000rpm、3‑5min，取上清液加入离心管C中，向离心管C中加入SDS‑PAGE蛋白上样缓冲液，所述上清液与SDS‑PAGE蛋白上样缓冲液的体积比为5:1，将离心管C移入金属浴中，在95℃处理5‑10min，恢复至室温，待离心管C中的气体液化后瞬时离心，将液滴离心到离心管C底部，得到蛋白样，在‑20℃保存；S2，SDS‑PAGE凝胶电泳流程，检查制胶板是否漏水，若不漏，则配制分离胶；向制胶板内加入3.5ml配好的分离胶，用异丙醇封分离胶的液面，待分离胶凝固后，将异丙醇倒掉，用去离子水清洗3遍，并用滤纸吸干；在分离胶凝固的过程中配制浓缩胶，浓缩胶的质量浓度为5％；将电泳梳子插入制胶板中，放梳子要从制胶板沿电泳方向的一边开始放，并将产生的气泡赶到另一边排出，使得制胶板内没有气泡，向制胶板中补满浓缩胶，静置30min；取S1中得到的蛋白样10μl，SDS‑PAGE蛋白上样缓冲液2μl，配成12μl体系，在95℃金属浴中处理至变性，在处理过程中压紧防止气化，变性后取出；点样，将变性后的蛋白样加入梳子的孔中，每孔的点样量为5‑15μl；在电压为80V下浓缩胶电泳30min，然后在120V下分离胶电泳1.5h或者在电压为100V下电泳2h，得到SDS‑PAGE胶；S3，转膜，将海绵放入转膜液中并赶走气泡，在海绵上放置3张对应大小的滤纸并赶走气泡，将S2中得到的SDS‑PAGE胶切取一块，得到待电泳的SDS‑PAGE胶，放置在滤纸中间，切取一块与待电泳的SDS‑PAGE胶大小一样的PVDF膜，在甲醇中浸泡5s，变灰激活后用去离子水冲洗去除甲醇，将PVDF膜与待电泳的SDS‑PAGE胶对齐放好,用夹子夹紧放入电泳槽中，槽内加1L转膜液，再将冰袋放置于电泳槽中，同时加入能稳定转膜槽内电压的转子，在65v恒压下转膜2h或200mA恒流下转膜2h；S4，封闭，配制TBST，所述TBST按照每100ml TBS中加入50μl吐温的比例配制；配制封闭液，所述封闭液按照每100ml TBST中加入5g脱脂奶粉的比例配制；封闭，将S3中转好的膜放入所述封闭液中，在室温下的摇床中以60rpm封闭1‑2h或者在4℃冰箱中封闭过夜；S5，孵育一抗，将S4中封闭后的膜用TBST清洗3次，每次至少5min；用TBST清洗自封袋3次，加4ml TBST到自封袋中，再加入内参一抗或者目的蛋白一抗到自封袋中配制成一抗孵育液，所述内参一抗孵育液的体积浓度为四千分之一，所述目的蛋白一抗孵育液的体积浓度为一千分之一；将TBST清洗后的膜加入所述自封袋中，室温下摇床中以60rpm孵育2h或者4℃冰箱中过夜孵育；S6，孵育二抗，用TBST清洗孵育过一抗的膜3次，每次至少5min，用TBST清洗自封袋3次，加4ml TBST到自封袋中，再加入与所述内参一抗或者目的蛋白一抗相对应的二抗到自封袋中配制成二抗孵育液，所述二抗孵育液的体积浓度为一千分之一；将TBST清洗后的孵育过一抗的膜加入所述自封袋中，室温下摇床中以60rpm孵育2h或者4℃冰箱中过夜孵育；S7，显影，用TBST清洗孵育过二抗的膜3次，每次至少5min，用纯水清洗膜3遍后，将膜表面的水吸干放入皿中，将超敏ECL化学发光试剂盒中的A、B液混合，均匀滴在膜上反复吹打至少5min，将自封袋沿其轴剪开呈开合状态的书页，将膜从皿中取出放置在自封袋上，使膜上待检测蛋白那一列与书页的轴平行，合上自封袋，沿着垂直于轴的方向将气泡清除，用多通道成像系统在10‑600s范围内进行曝光。