[发明专利]一种mRNA的正义链的整体扩增方法

摘要

本发明涉及一种整体扩增mRNA的正义链的方法，解决了常规的mRNA提取方法不足以满足实验所需用量的问题，步骤如下a.合成12种寡核苷酸，每种寡核苷酸的序列为4部分，从5’端开始，第1部分为一段通用模板序列，作为后续扩增反应时引物结合的模板，第2部分为A、C两个碱基，第3部分为重复T寡核苷酸，第4部分2个碱基为G或A或C与G或A或C或T的随机组合；b.将12种寡核苷酸混合；c.将总RNA与寡核苷酸混合液、逆转录酶和逆转录缓冲液混合，进行逆转录反应，并在反应过程中间阶段加入寡核苷酸Cap，继续进行逆转录反应；d.逆转录产物为模板，寡核苷酸P1、P2为引物进行扩增。

主权项

一种mRNA的整体扩增方法，其特征在于包括如下步骤：a.分别合成以下寡核苷酸：12种寡核苷酸Oligo‑1～Oligo‑12，其每种寡核苷酸的序列分为4个部分，从5’端开始，第1部分为一段通用模板序列，可以作为后续扩增反应时引物结合的模板，第2部分为A、C两个碱基，第3部分为重复T寡核苷酸，第4部分2个碱基为G或A或C与G或A或C或T的随机组合；寡核苷酸Cap，其寡核苷酸的序列分为3个部分，从5’端开始，第1部分为RNA聚合酶的启动子序列，第2部分为C，第3部分为GGG；寡核苷酸P1，其寡核苷酸的序列分为3个部分，从5’端开始，第1部分为一段通用模板序列，第2部分为RNA聚合酶的启动子序列，第3部分为C；寡核苷酸P2；其寡核苷酸的序列，从5’端开始，为RNA聚合酶的启动子序列；b.将步骤a制备的12种寡核苷酸Oligo‑1～Oligo‑12分别取相同摩尔量混合，配制成每种寡核苷酸浓度含量相同的寡核苷酸混合液；c.将从标本中提取的总RNA与步骤b制得的寡核苷酸混合液、逆转录酶和逆转录缓冲液混合，进行逆转录反应，并在反应过程总时间的中间点加入步骤a制备的寡核苷酸Cap，继续进行逆转录反应；d.以步骤c获得的逆转录产物为模板，以步骤a中制备的寡核苷酸P1、P2为引物进行PCR扩增，扩增产物经DNA纯化后回收；e.将步骤e所获得的扩增产物与RNA聚合酶和体外转录缓冲液混合，进行体外转录反应，体外转录产物经RNA纯化后回收，回收产物即为整体扩增的mRNA。