[发明专利]基于介孔颗粒的荧光适配体检测microRNA方法

摘要

本发明属于生物工程技术领域，公开了一种基于介孔颗粒的荧光适配体检测microRNA方法，以介孔聚多巴胺纳米颗粒为载体，以荧光素标记的核酸适配体为探针，探针装载进入介孔孔道发生效率为97％的高效荧光猝灭；microRNA识别孔内探针形成的双链核酸复合体能高效脱离颗粒形成荧光恢复；最后，以DNA限制性内切酶I剪切功能实现信号放大功能，能使信噪比达到45，检测microRNA浓度范围为10pM‑100nM，检测限为0.04nM。本发明有利于基于纳米猝灭剂的高信噪比microRNA检测方法的开发。

主权项

1.一种microRNA纳米检测系统，其特征在于，所述microRNA纳米检测系统以介孔聚多巴胺纳米颗粒为载体，以荧光素标记的核酸适配体为探针，探针装载进入介孔孔道发生荧光猝灭；microRNA识别孔内探针形成的双链核酸复合体脱离颗粒形成荧光恢复；以DNA限制性内切酶I(DNase I)的剪切功能实现信号放大功能，检测microRNA的浓度范围为10pM‑100nM；所述介孔聚多巴胺纳米载体颗粒粒径为50nm～100nm，介孔孔径为4nm～40nm；基于所述microRNA纳米检测系统的纳米载体建立方法包括以下步骤：步骤一，在烧瓶中加入180mg～540mg嵌段共聚物F127、180mg～540mg均三甲苯、50mL～70mL无水乙醇、50mL～100mL去离子水，搅拌10min～60min后加入60mg～120mg三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、40mg～100mg多巴胺盐酸盐，室温搅拌20小时～30小时；步骤二：取反应原液与丙酮混匀，反应原液与丙酮的体积比5:2～5，11000rpm离心10min～20min，弃上清；加入20mL无水乙醇和10mL丙酮，超声20min～60min，11000rpm离心5min～20min，重复两次；最后收集沉淀即为介孔聚多巴胺纳米载体，将其分散于无水乙醇中保存；所述纳米载体建立方法建立的纳米载体的检测microRNA的方法包括以下步骤：步骤一，荧光适配体的装载，在1mL检测缓冲液中加入10～120μg介孔聚多巴胺纳米颗粒和50nM羟基荧光素标记的核酸适配体，混匀30min，作为检测体系；步骤二，microRNA样品检测，在检测体系中加入含有待检测microRNA的样品和10U～100U的DNA限制性内切酶I，37℃混匀20min～200min；将待荧光分析的溶液加入到石英比色皿中，利用荧光分光光度计检测荧光强度，激发光波长为480nm，发射光波长为523nm，以荧光强度的增加表示microRNA的量；所述步骤一中检测缓冲液溶剂为去离子水，其溶液组分及含量为：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，20毫摩尔每升；氯化钠，140毫摩尔每升；氯化钾，5毫摩尔每升；氯化钙，1毫摩尔每升；氯化镁，1毫摩尔每升；pH为7.6。