[发明专利]海洋高等植物腐叶总DNA的提取方法

摘要

本发明公开了一种海洋高等植物腐叶总DNA的提取方法，涉及生物技术领域，其海洋高等植物包括海草和红树植物两大类，尤其针对多糖多酚含量较高的植物腐叶。本发明的洗脱液中含有质量浓度为20 g/L的聚乙烯吡咯烷酮和体积分数为0.3% 的2‑巯基乙醇，两者的联合作用能够使多糖多酚等在有机溶剂的抽提中较好地去除。由于水浴时间和异丙醇沉淀时间会对DNA纯度和产率有影响，本发明认给出的水浴及沉淀时间效果佳，能够得到浓度较高杂质较少的DNA。本发明得到的总DNA质量总体较高，能够满足后续实验，如PCR等对DNA质量的要求。

主权项

一种海洋高等植物腐叶总DNA的提取方法，其特征在于，该方法包括以下具体步骤：a)取海洋高等植物腐叶，用液氮研磨，磨碎后加入洗脱液，0.1g腐叶加1‑2ml洗脱液，转入离心管中，在高速冷冻离心机上10,000rpm，0‑10℃离心10‑15min；b)弃上清液，立即添加预热至50‑65℃的提取缓冲液，0.1g腐叶加0.5‑1ml提取缓冲液，用搅拌棍充分搅拌均匀；50‑65℃水浴10‑30min；期间每10分钟上下混匀一次；水浴结束后取出冷却至室温；c)加入与提取缓冲液等体积的氯仿与异戊醇的混合液，上下颠倒离心管数次，直到形成乳浊液为止；在高速冷冻离心机上，以13,000rpm，0‑10℃离心10‑15min；其中，氯仿与异戊醇的体积比为24:1；d)吸取上清液，转移至一标记好的新离心管中，加入等体积的氯仿与异戊醇的混合液，13,000rpm，0‑10℃离心10‑15min；e)吸取上清液，加入10mg/ml的RNaseA，400μl上清液加入2‑3μl RNaseA,35‑40℃水浴10‑60min，冷却至室温；f)加入等体积的氯仿与异戊醇的混合液，使之形成乳浊液，13,000rpm，0‑10℃离心10‑15min；g)吸取上清液，加入2倍体积预冷为‑20℃的无水乙醇，轻轻地混匀，出现白色絮状沉淀，将混合物置于‑20℃冷冻10‑60min；h)13,000rpm，0‑10℃离心10‑15min；将上清液从离心管中倒出，保留沉淀在离心管中；i)加入预冷的1‑2ml 70％乙醇以清洗沉淀，10,000rpm，0‑10℃离心5‑10min；j)弃上清液，将离心管倒置于铺有吸水纸的工作台上，自然风干,得到DNA沉淀；k)加入TE缓冲液，以溶解沉淀；得到所述海洋高等植物腐叶总DNA储存液；其中：所述海洋高等植物包括海草类和红树植物类；所述洗脱液为100mmol/L的Tris‑HCl，pH 8.0、1.4mol/L的NaCl、20mmol/L的EDTA、质量浓度为20g/L的聚乙烯吡咯烷酮和体积分数为0.3％的2‑巯基乙醇，该浓度为配成后的浓度，即每100mL该洗脱液中含有1M Tris‑HCl 10mL、5M NaCl 28mL、0.5M EDTA 4mL、2g聚乙烯吡咯烷酮和30μl 2‑巯基乙醇；所述提取缓冲液为100mmol/L的Tris‑HCl，pH 8.0、1.4mol/L的NaCl、20mmol/L的EDTA，pH8.0、质量浓度为20g/L的CTAB、质量浓度为20g/L的的聚乙烯吡咯烷酮和体积分数为0.3％的2‑巯基乙醇，即每100mL该提取缓冲液中含有1M Tris‑HCl 10mL、5M NaCl28mL、0.5M EDTA 4mL、2g CTAB、2g聚乙烯吡咯烷酮和30μl 2‑巯基乙醇。