[发明专利]针对香石竹较大外植体叶芽和花芽的石蜡切片方法

摘要

本发明公开一种针对香石竹较大外植体叶芽和花芽的石蜡切片方法，包括取材与固定、清洗和染色、脱水、透明、浸蜡与包埋、切片、展片和贴片、脱蜡与封片等步骤。采用本发明提供的方法，能有效处理因香石竹外植体叶芽和花芽材料过大，切片不完整、不连续、存在空洞的问题。可以良好的固定组织发育的各个时期，能够观察到叶芽和花芽发育的整个过程，且操作简单，具有很好的开发应用价值。

主权项

一种针对香石竹较大外植体叶芽和花芽的石蜡切片方法，其特征在于包括以下步骤：（1）取材与固定：取不同发育时期的香石竹叶芽或花芽，芽的长度为0.5～3cm，并将芽从中央纵切成两半，再快速置于FAA固定液中，固定24h，并在4℃冰箱中保存；（2）清洗和染色：将步骤（1）所得材料用蒸馏水清洗3次，每次2～5min；再以苏木素染液染色24h后，用蒸馏水清洗3次，每次2～5min，再用浓度为70v/v%的乙醇清洗2次，每次10min；（3）脱水：以浓度为70v/v%的乙醇脱水12～24h，弃乙醇，将材料以2000～3000转/分钟进行离心分离1～2min，换管，用浓度为85v/v%的乙醇脱水1.5～2h，弃乙醇，以3000转/分钟离心分离1～2min，换管，再用浓度为95v/v%的乙醇脱水1.5～2h，弃乙醇，以3000转/分钟离心分离1～2min，换管，无水乙醇脱水50～70min，弃乙醇，以3000转/分钟离心分离1～2min，换管，无水乙醇脱水50～70min，弃乙醇，以3000转/分钟离心分离1～2min，将材料放入10mL离心管内；（4）透明：加入2 mL无水乙醇+1mL二甲苯浸泡50～70min，以3000转/分钟离心分离1～2min，除去液体，再加入2mL无水乙醇+2mL二甲苯后浸泡50～70min，以3000转/分钟离心分离1～2min，除去液体，再加入2mL二甲苯浸泡50～70min，以3000转/分钟离心1～2min，除去液体，再加入2mL二甲苯浸泡50～70min，以3000转/分钟离心分离1～2min，除去液体，将材料放入青霉素小瓶内；（5）浸蜡与包埋：常温下将削好的适量蜡屑投入盛有材料的青霉素小瓶中，于35℃下恒温过夜，再加入蜡屑至饱和，于42℃下恒温过夜，然后全部换纯蜡，于60℃下恒温12小时，再次全部换纯蜡，于60℃恒温12小时；包埋前1小时打开包埋机预热，再将熔好的蜡倒入预先折好的小纸盒中用镊子或解剖针将材料夹到纸盒中，并摆好位置，包埋后将纸盒移入冷台上，使石蜡逐渐凝固；（6）切片：将已修好并固定的石蜡块台木装在切片机的夹物台上，切片刀固定在刀夹上，扭动推动螺旋，使石蜡块与刀口贴近，并调整它们之间的角度，调整厚度计，控制切片厚度为8～10μm，得到蜡带；（7）展片和贴片：在清洁的载玻片上滴2～3滴蒸馏水，用小镊子夹取切好的蜡带，放在水面上，使蜡片展开，然后把载玻片置于42℃温箱烘干1～2d；（8）脱蜡与封片：将材料依次放入1/2无水乙醇+1/2二甲苯浸泡15～30min→二甲苯浸泡15～30min→二甲苯浸泡45～60min，再进行脱蜡处理，之后取出；等切片表面的二甲苯挥发后，滴一滴加拿大树胶，取干净的盖玻片从树胶滴一侧放下盖好，避免产生气泡；贴上标签，放在烘箱中充分脱苯，之后收入切片盒中。