[发明专利]一种人羊膜间充质干细胞的分离培养方法

摘要

本发明公开了一种羊膜间充质干细胞的分离培养方法，属于生物技术领域。一种羊膜间充质干细胞的分离培养方法，包括：(一)细胞分离；(二)细胞培养：将分离的人羊膜单个核细胞接种于塑料培养瓶，培养于37℃，培养箱，培养液为人羊膜间充质干细胞专用培养基；24小时后换液，弃非贴壁细胞，以后每2～3天换液；待人羊膜间充质干细胞生长到70～80％融合，用胰酶消化，传代；每2～3天用人羊膜间充质干细胞专用培养基中传代一次，每次传代培养的条件均为37℃，本发明得到的人羊膜间充质干细胞是表达如下三种细胞膜分子：人白细胞分化抗原CD73、人白细胞分化抗原CD90和人白细胞分化抗原不表达人白细胞分化抗原和人白细胞抗原HLA‑DR。

主权项

人羊膜间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于步骤如下：(一)细胞分离(1)羊膜取自足月剖宫产健康产妇，采集后6～12h处理；(2)将直径为6cm×6cm的羊膜用0.9％氯化钠溶液清洗，剪碎至约1mm×1mm×1mm，经0.1％胶原酶和0.125％的胰酶37℃消化30～60min，用α‑MEM培养基稀释至40ml；(3)将上述液体先后用100目及200目滤网过滤，去未消化的组织；(4)过滤后的含细胞的液体置于50ml离心管中，配平后放置在低温离心机内，以离心力300Xg，温度4±2℃，离心8分钟；(5)停机后轻轻取出离心管置于试管架上，离心管内容物分为二部分，上层为胶原酶、胰酶和α‑MEM培养基，下层为组织碎块与细胞混合物；(6)将上层胶原酶、胰酶和α‑MEM培养基吸出；(7)将所分离的人羊膜单个核细胞用α‑MEM培养基稀释后2000r/min离心10min洗二次；(二)细胞培养将分离的人羊膜单个核细胞按1×106个细胞/cm2接种于75cm2塑料培养瓶，培养于37℃，5％CO2培养箱，培养液为人羊膜间充质干细胞专用培养基；24小时后换液，弃非贴壁细胞，以后每2～3天换液；待人羊膜间充质干细胞生长到70～80％融合，用0.25％胰酶消化，按0.8×104～1.0×104个细胞/cm2传代；每2～3天用人羊膜间充质干细胞专用培养基中传代一次，使细胞浓度维持在5×105～10×105个细胞/Ml；每次传代培养的条件均为37℃，5％CO2；传5代得到人羊膜间充质干细胞。