[发明专利]基于人iPS细胞获取脊髓运动神经元及其功能性细胞的方法

摘要

本发明属于生物医学领域，涉及一种安全可靠重编程获得人iPS细胞的方法、一种将iPS细胞简便快速高效诱导分化成为脊髓运动神经元的方法，以及一种经济有效的功能性脊髓运动神经元的获取方法及其应用。本发明以玻连蛋白为唯一生长介质，由携带重编程因子的仙台病毒感染人成纤维细胞，培养3周后获得无外源血清干扰的人iPS细胞；之后通过多种小分子化合物组合将人iPS细胞高效诱导分化成为脊髓运动神经元；进一步经星形胶质细胞条件培养基促成熟培养并在神经肌肉接头的形成中应用。本发明高效诱导获得的功能性脊髓运动神经元，可用于疾病表型的模拟和发病机制的探讨，为今后有效治疗药物的筛选提供理论依据；甚至将来可应用于疾病的细胞移植治疗。

主权项

基于人iPS细胞高效获取功能性脊髓运动神经元的方法，其特征在于该方法主要步骤为：一、重编程获得人iPS细胞微创获取人皮肤成纤维细胞，经携带重编程因子hOct3/4、hSox2、hKlf4与hc‑Myc的仙台病毒感染后，于DMEM完全培养基中培养7天；再用完全培养基重悬，并以1:5比例重新接种至玻连蛋白包被处理过的孔板内培养24小时；之后更换为E8干细胞培养基，并从次日起每日进行全量换液，直至2周后即可获得iPS细胞；挑取iPS细胞单克隆，接种至预先包被有玻连蛋白或基质胶的孔板内进行扩增培养并用于之后的运动神经元的诱导分化；二、运动神经元的诱导分化(1)将培养至70％‑85％融合度的人iPS细胞消化并悬浮培养于含有小分子化合物组合I的神经元诱导分化培养基中2天；(2)将细胞移至含有小分子化合物组合II的神经元诱导分化培养基中继续悬浮培养2天；(3)将细胞移至含有小分子化合物组合III的神经元诱导分化培养基中持续悬浮培养5天；(4)将细胞消化贴壁培养3天即可获得运动神经元，此间神经元诱导分化培养基中只加入小分子化合物DAPT；所述步骤(1)的神经元诱导分化培养基为混合成分，分别含有1：1的DMEM/F12和Neurobasal培养基、0.5x B27添加剂、0.5x N2添加剂、1x谷氨酰胺和1x非必需氨基酸；所述步骤(1)所添加的小分子化合物组合I组成及浓度为：DMH1 2μM+SB431542 2μM+CHIR9902 3μM或LDN193189 0.3μM+SB431542 2μM+CHIR99021 3μM；所述步骤(2)的神经元诱导分化培养基中额外添加的小分子化合物组合II组成及浓度如下：小分子化合物组合I+RA 0.1μM+SAG 0.5μM；所述步骤(3)的神经元诱导分化培养基中额外添加的小分子化合物组合III组成及浓度如下：RA 0.1μM+SAG 0.5μM；所述步骤(4)中首先使用Accutase酶消化，再将神经元接种至包被有多聚鸟氨酸、层粘连蛋白及基质胶包被处理过的玻片上；细胞贴壁完全后，加入含有小分子化合物DAPT的神经元诱导分化培养基；三、功能性运动神经元的培育将步骤二(3)中悬浮培养结束的神经元进行消化，再接种至预先包被有多聚鸟氨酸、层粘连蛋白及基质胶玻片上，以星型胶质细胞条件培养基作为基础培养基，并同时添加小分子化合物DAPT 10μM；每3天，半量更换新鲜培养基一次，直至诱导分化第31天为止；所述星形胶质细胞条件培养基的制备过程为：采用DMEM完全培养基培养星形胶质细胞3天，再加入新鲜的神经元诱导分化培养基，之后每日进行收集，并更换新鲜的神经元诱导分化培养基。