[发明专利]使用RNA指导型内切核酸酶改善基因组工程特异性的组合物和方法

摘要

本文披露了优化指导RNA(gRNA)以及设计和使用具有增加的靶结合特异性和减小的脱靶结合的所述优化gRNA的方法。

主权项

1.一种产生优化指导RNA(gRNA)的方法，该方法包括：a)鉴定感兴趣的靶区，该感兴趣的靶区包含原型间隔子序列；b)确定靶向该感兴趣的靶区的全长gRNA的多核苷酸序列，该全长gRNA包含原型间隔子靶向序列或区段；c)确定该全长gRNA的至少一个或多个脱靶位点；d)产生第一gRNA的多核苷酸序列，该第一gRNA包含该全长gRNA的该多核苷酸序列和RNA区段，该RNA区段包含具有M个核苷酸长度的多核苷酸序列，该多核苷酸序列与该原型间隔子靶向序列或区段的核苷酸区段互补，该RNA区段位于该全长gRNA的该多核苷酸序列的5’端，该第一gRNA任选地包含在该全长gRNA的多核苷酸序列的5’端与该RNA区段之间的接头，该接头包含具有N个核苷酸长度的多核苷酸序列，该第一gRNA能够入侵该原型间隔子序列，并且结合与该原型间隔子序列互补的DNA序列并形成原型间隔子‑双链体，并且该第一gRNA能够入侵脱靶位点并结合与该脱靶位点互补的DNA序列并形成脱靶双链体；e)计算入侵动力学和该第一gRNA保持入侵在该原型间隔子和脱靶位点双链体中的寿命的估计值或计算模拟这些入侵动力学和寿命，其中通过确定不同gRNA的进一步入侵与将该第一gRNA重新退火至与该原型间隔子序列互补的该DNA序列之间的能量差来逐个核苷酸地估计入侵动态；f)将该第一gRNA在该原型间隔子和/或脱靶位点的估计寿命与该全长gRNA或截短gRNA(tru‑gRNA)在该原型间隔子和/或脱靶位点处的估计寿命进行比较；g)将该接头中的0至N个核苷酸和第一gRNA中的0至M个核苷酸随机化并产生第二gRNA，并且用该第二gRNA重复步骤(e)；h)基于满足设计标准的gRNA序列鉴定优化gRNA；并且i)在体内测试该优化gRNA以确定结合特异性。