[发明专利]一种复合组织工程皮肤的构建方法

摘要

本发明公开了一种复合组织工程皮肤的构建方法，是采用人表皮干细胞作为种子细胞，羊脱细胞真皮基质作为支架载体，利用气液界面分离法体外培养构建复合组织工程皮肤。以本发明方法构建的复合组织工程皮肤具有理想的三维立体网状结构，能促进细胞生长和形成新的胶原纤维，构建时间短，组织学结构完整，更接近于天然皮肤，达到了组织工程皮肤形态学的要求。

主权项

1.一种复合组织工程皮肤的构建方法，是以Disapse—胰蛋白酶两步消化法从人源性皮肤中分离培养表皮干细胞，以高渗盐—NP‑40—胰蛋白酶‑EDTA法制备羊脱细胞真皮基质支架，将培养的表皮干细胞接种于羊脱细胞真皮基质支架上，气液界面分离培养构建复合组织工程皮肤，具体按照下述步骤构建：1）以生理盐水清洗干净剔除脂肪及皮下组织的人源性皮肤，浸入DisapseⅡ中4℃消化；分离出表皮皮片置于胰蛋白酶‑EDTA消化液中常温消化，血清终止消化；过滤，离心弃上清，培养基重悬细胞；将重悬细胞接种在预先包被有0.5g/L IV型胶原的培养皿内，置于体积分数5% CO₂、37℃孵箱中培养15min，吸掉未贴壁细胞，保留贴壁细胞，重新加入培养基进行培养，待细胞长至70%～80%满时，进行传代培养；收集1～5代培养的表皮干细胞作为种子细胞；2）将除去皮下组织、保留表皮与真皮部分的羊皮浸入1mmol/L NaCl溶液中振荡24h脱去表皮；加入到NP‑40中，常温下摇床持续震摇24h脱去残余细胞及碎片；浸入胰蛋白酶‑EDTA消化液中常温消化20min，取出，以PBS缓冲液反复冲洗，得到羊脱细胞真皮基质支架；3）将培养好的表皮干细胞接种在羊脱细胞真皮基质支架上，用培养基将真皮基质支架完全浸没，于37℃、体积分数5% CO₂培养箱中培养1周，转移至网架上，添加新鲜培养基，使培养基液面与真皮基质支架底部平齐，从而使表皮干细胞部分暴露于空气中，气液界面分离培养1周，得到复合组织工程皮肤。