[发明专利]一种黄鳝醛酮还原酶多克隆抗体的制备方法

摘要

本发明公开了一种黄鳝醛酮还原酶多克隆抗体的制备方法，包括(1)黄鳝Eakr基因的克隆；(2)黄鳝Eakr基因重组表达载体的构建；(3)黄鳝Eakr重组蛋白的诱导表达和纯化；(4)多克隆抗体的制备及Western blot分析。本发明采用分子生物学和基因工程的方法，构建了黄鳝Eakr基因的重组表达载体，诱导表达，亲和层析获得纯化的重组表达蛋白。本发明的方法制备的黄鳝Eakr多克隆抗体可用于免疫组化、免疫印迹实验要求，建立体外免疫分析、研究黄鳝Eakr的功能以及黄鳝免疫荧光染色激光共聚焦显微观察，还可用于草鱼、黄颡、团头鲂、乌鳢和鲫鱼的醛酮还原酶的免疫检测。

主权项

1.一种黄鳝醛酮还原酶多克隆抗体的制备方法，其特征在于,包括以下步骤：步骤(1)黄鳝Eakr基因的克隆：提取黄鳝总RNA，用M‑MLV反转录酶合成cDNA第一链，于‑80℃保存；根据GenBank数据库中已报道的AKR基因序列，设计第一对特异性引物，进行PCR扩增，获得黄鳝Eakr基因cDNA片段；进行5’RACE‑PCR和3’RACE‑PCR扩增，获得黄鳝Eakr基因cDNA片段的5’末端和3’末端，拼接获得黄鳝Eakr基因全长cDNA序列；黄鳝Eakr基因的核苷酸和氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；步骤(2)黄鳝Eakr基因重组表达载体的构建：根据黄鳝Eakr基因全长cDNA序列，设计第二对特异性引物re‑ex‑F和re‑ex‑R，分别在上、下游引物添加了EcoR I和Hind III酶切位点；以黄鳝cDNA为模板，re‑ex‑F和re‑ex‑R为引物，进行PCR扩增；将PCR产物和pET‑28a(+)表达载体进行双酶切，回收纯化，连接转化大肠杆菌DH5α，获得重组表达载体pET‑Eakr；步骤(3)黄鳝Eakr重组蛋白的诱导表达和纯化：将步骤(2)得到的重组表达载体pET‑Eakr转化大肠杆菌BL21(DE3)，在含有50mg/L卡那霉素的LB培养液中培养至OD值为0.6时，加入IPTG进行诱导；离心收集菌体，超声破碎，然后加入5×上样缓冲液进行12％SDS‑PAGE电泳检测目标蛋白的表达情况；以1％的接种量将能表达重组蛋白的BL21添加到含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，大量培养，诱导表达；将诱导好的菌液离心，收集菌体超声波破碎，再离心收集沉淀；将沉淀用平衡缓冲液溶解，收集上清，上样、结合、洗脱、透析，获得纯化的黄鳝Eakr重组蛋白；SDS‑PAGE电泳检测纯化的黄鳝Eakr重组蛋白；步骤(4)多克隆抗体的制备及Western blot分析：将步骤(3)纯化的黄鳝pET‑Eakr重组蛋白作为抗原，对新西兰大白兔进行8次免疫，按体积比1：1的比例加入弗氏完全佐剂，采用背部皮下多点注射；加强免疫选用弗氏不完全佐剂；末次免疫10天后，进行全血分离，收集兔抗血清，纯化得到黄鳝Eakr多克隆抗体。