[发明专利]一种弓形虫串联多表位基因ELISA检测试剂盒

摘要

本发明涉及一种弓形虫串联多表位基因ELISA检测试剂盒，其特征在于将待检血清用样品稀释后，加入100ul至96孔ELISA板（1）中37℃孵育1h，设置阳性对照、阴性对照和空白对照。用洗涤液清洗5次，每次3min；然后加入兔抗羊IgG‑HRP结合物37℃作用1h，洗涤液清洗5次，每次3min；然后加入显色底物溶液，将底物A和底物B以11混合，100ul加入ELISA孔中，避光显色15min，加入50ul终止液，测其OD490值。判定结果是这样设定的抑制率PI=(OD阴性对照‑OD样品) /OD阴性对照*100%，PI≥50%对应的样品为阳性，小于则为阴性。该试剂盒方法技术成熟，重复性强，能够有效减少弓形虫的检测中出现的假阳性和不可重复性，一般研究人员即可完成。

主权项

一种弓形虫串联多表位基因ELISA检测试剂盒，包括96孔ELISA板、样品稀释液、20倍浓缩洗涤液、兔抗羊IgG‑HRP结合物、串联MIC1、MAG1、SAG1基因表达纯化蛋白、终止液、底物A、底物B、阳性样品、阴性样品、盖板膜；其特征在于：1）96孔ELISA板是将串联MIC1、MAG1、SAG1基因纯化蛋白稀释到10ug/mL，每孔100ul包被ELISA板，37℃孵育1h，洗涤后加入5%的BSA封闭液，37℃封闭1h，洗涤后真空封装；2）样品稀释液是将NaCl 8.0g；KH2PO4 0.2g；Na2HPO4 ·12H2O 2.9g；KCl 0.2g补加二馏水致1000ml;加入0.5ml Tween‑20，最后50ml分装；3）20倍浓缩洗涤液是将NaCl 160.0g；KH2PO4 4g；Na2HPO4 ·12H2O 58g；KCl 4g补加二馏水致1000ml;加入10ml Tween‑20，最后50ml分装；4）兔抗羊IgG‑HRP结合物是将10ml PBST加入5ul兔抗羊IgG‑HRP二抗，然后加入4%PEG,25ml分装；串联MIC1、MAG1、SAG1基因表达纯化蛋白是根据GenBank中弓形虫MIC1、MAG1、SAG1序列，设计特异性引物，根据GenBank中弓形虫MIC1、MAG1、SAG1序列，设计特异性引物如下：MIC1‑F:GGATCCGCGTCGCATTCTCATTCG          BamH I, 24bp, 18, GC% 58.3, Tm 74.2‑R:GAATTCGGCCTTCTCGTAACACCTCC        EcoR I,,26bp, GC%53.8, Tm 69.5MAG1‑F:GAATTCAGCCAAAGGGTGCCAGAG          EcoR I ,24bp, GC%54.2, Tm 69.0‑R:AAGCTTAGATCCCTGAACCCTTAGAATATACAC Hind III, 33bp, GC% 39.4, Tm 65.5SAG1‑F:AAGCTTGATCCCCCTCTTGTTGCC          Hind III, 24bp, GC%54.2, Tm69.4‑R:CTCGAGAAGAGTGCTGTCTGCACCGT        Xho I , 26bp, GC%57.7,Tm 71.1通过RT‑PCR技术扩增分别扩增弓形虫MIC1、MAG1、SAG1基因，通过RT‑PCR技术扩增弓形虫MIC1、MAG1、SAG1基因，将目的片段克隆到T载体，经酶切鉴定和测序分析，结果证明获得MIC1、MAG1、SAG1基因；将多表位基因与原核表达载体pET‑28a相连接，转化至大肠杆菌中，以IPTG诱导，经SDS‑PAGE和Western blotting分析MIC1、MAG1、SAG1蛋白；应用Ni‑NTA对表达蛋白进行纯化，获得理想浓度的纯化蛋白；终止液是将2mol/L H2SO4 浓硫酸44.5ml，双蒸水355.5ml，10ml分装；5）底物A：TMB 200mg，无水乙醇100ml,加双蒸水至1000ml，10ml分装；7）底物B：（0.1ml/L柠檬酸‑0.2ml/L磷酸氢二纳，pH5.0‑5.4）:Na2HPO4 14.60g，柠檬酸9.33g，0.75%过氧化氢尿素6.4ml，加三蒸水至1000ml，调至pH5.0‑5.43，10ml分装；8）阳性样品：将标准弓形虫阳性血清1:5稀释于样品稀释液中，1ml分装；9）阴性样品：将经检测弓形虫阴性血清1:5稀释于样品稀释液中，1ml分装。