[发明专利]一种响应面法优化长枝木霉T6产孢量的发酵方法

摘要

本发明所提供了一种响应面法优化长枝木霉T6产孢量的发酵方法，通过对不同培养基质的长枝木霉T6产孢量进行对比，得到最佳的培养基质为草炭蛭石牛粪为111的配比；再通过对含水量、接种量、透气性、发酵周期和pH等发酵条件的研究以及采用响应面优化进行分析计算，得到最佳的发酵条件为含水量64％、接种量57％、透气性9层纱布。

主权项

一种响应面法优化长枝木霉T6产孢量的发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：A、长枝木霉T6孢子悬浮液的制备：将低温保存的长枝木霉T6菌种活化后，打成直径为5mm的菌块，接种于PDA培养基，于28℃恒温培养箱中光暗交替培养，4d后加入10mL无菌水并滴入2滴吐温‑80，缓慢摇晃，使分生孢子充分脱落，用无菌水将原液稀释为107cfu·ml‑1，备用；B、长枝木霉T6液体菌种的制备：取制备好的液体培养基75mL于150mL三角瓶中，1×105Pa高压灭菌后，接入1mL浓度为10 7cfu·mL‑1长枝木霉T6孢子悬浮液，28℃、140r/min培养5d，待用；C、长枝木霉T6固体菌种的制备：将麸皮、玉米粒按3：1配比，置于罐头瓶中，厚度为2cm，加50％水拌匀后，4层纱布封口，于121℃高压灭菌60min；取出后冷却至室温，以20％的接种量(v/w)接入制备好的液体菌种，混匀于28℃下培养7d后，取出再放入30℃的干燥箱烘干；D、长枝木霉T6固体培养基质的制备：将腐熟的麦秸秆、牛粪以及菇渣、草炭、蛭石粉碎后过80目筛，按菇渣：牛粪：麦秸秆1:1:1、菇渣：牛粪：麦秸秆1:1:2、菇渣：牛粪：麦秸秆1:2:1、菇渣：牛粪：麦秸秆2:1:1、草炭：蛭石：牛粪1:1:1配比，置于罐头瓶中，厚度3cm，1×105Pa高压灭菌60min；初设牛粪为对照，含水量50％，接种量50％，pH值5.6(用磷酸氢二钠‑柠檬酸缓冲液调试)，4层纱布封口，温度25℃，培养20d；每个处理3次重复；E、长枝木霉T6固体发酵条件的优化：调整含水量、接种量、透气性、发酵周期和pH等发酵条件，研究这些条件对长枝木霉T 6产孢量影响；F、长枝木霉T6产孢量的测定：称取1g培养20d的长枝木霉T 6培养基质，加入100mL蒸馏水，滴入两滴吐温‑80，置于磁力搅拌器，搅拌20min后，统计孢子的数量；每个处理3次重复；G、长枝木霉T6固体发酵条件响应面优化：根据单因素试验的结果，以长枝木霉T6在不同培养基质中的产孢量为响应值，选出影响显著的3个主要因素，采用Box‑Behnken中心组合设计试验，对培养条件进行响应面法实验设计，以获得最佳的发酵优化条件。