[发明专利]一种用于检测电子烟制品对细胞活性氧分泌影响的方法

摘要

本发明公开一种用于检测电子烟制品对细胞活性氧分泌影响的方法，其包括如下步骤：(1)受试物的前处理；(2)人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的制备；(3)人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的细胞浓度的计算；(4)人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的细胞接种；(5)受试物的分组；(6)受试物检测剂量的设定；(7)受试物培养品的制备；(8)受试物的孵育；(9)加入阳性对照物；(10)装载探针；(11)样品测定；(12)活性氧水平计算。本发明对样品的有效处理、检测剂量的优化设定以及靶细胞的正确选择，使得本方法能够准确有效的检测电子烟制品对细胞活性氧水平影响的方法。

主权项

1.一种用于检测电子烟制品对细胞活性氧分泌影响的方法，其特征在于，包括以下具体步骤：(1)受试物的前处理：吸取一定量的电子烟原液，按照电子烟原液与无血清细胞培养基的体积比为10～90％的比例进行混合稀释后，放置24h‑48h，无菌过滤器过滤除菌，得到待测液，‑80℃保存待用；(2)人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的制备：人肺成纤维细胞复苏后，接种到细胞培养瓶中，置于37℃、5vt％CO2培养箱中培养，倒置显微镜观察培养细胞的汇合和形态情况，待细胞长至90％的汇合率时，移除培养瓶中的培养基，用磷酸缓冲液洗两次，加入适量0.25％的胰蛋白酶溶液，其中胰蛋白酶/磷酸盐缓冲液的浓度单位为质量：体积；单层孵育1‑2min，用成纤维成纤维细胞培养基悬起，形成单细胞悬浮液；(3)人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的细胞浓度的计算：用血球计数板计数法对步骤(2)得到人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，计算出每毫升人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的活细胞数；(4)人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的细胞接种：将步骤(3)计数后的人肺成纤维细胞单细胞悬浮液加入成纤维细胞培养基稀释至2.0×105个/mL，再按接种量为200μL/孔，接种到96孔细胞培养板中，将96孔细胞培养板置于37℃、5vt％CO2培养箱内培养24h；(5)受试物的分组：将受试物分为四组：空白组、细胞对照组、阳性对照组和检测样品组；各组的构成为：空白组只加成纤维细胞培养基；细胞对照组为成纤维细胞生长培养基上种植人肺成纤维细胞；阳性对照组为在成纤维细胞生长培养基上种植人肺成纤维细胞并添加阳性对照物；检测样品组为在成纤维细胞生长培养基上种植人肺成纤维细胞并添加受试物；每个检测计量设4孔平行；(6)受试物检测剂量的设定：将受试物，即电子烟原液分为5个非零剂量：25mg/mL、50mg/mL、100mg/mL、150mg/mL、200mg/mL；(7)受试物培养品的制备：移除步骤(4)中96孔细胞培养板内的成纤维细胞培养基，再按步骤(5)进行分组，各组的构成为：空白组只加成纤维细胞培养基；细胞对照组为成纤维细胞培养基+人肺成纤维细胞；阳性对照组为成纤维细胞培养基+人肺成纤维细胞+阳性对照物；检测样品组为成纤维细胞培养基+人肺成纤维细胞+受试物，并使检测样品组的最终浓度分别为步骤(6)设定的剂量；并且4组培养品用成纤维细胞培养基将每孔中的液体体积补足到200μl/孔；(8)受试物的孵育：将步骤(7)加样后的96孔细胞培养板置于37℃、5vt％CO2培养箱中孵育24h；(9)加入阳性对照物：取4孔正常细胞，去除培养基，加入100μL浓度为50mg/mL的阳性对照物，将96孔细胞培养板置于37℃、5vt％CO2培养箱中孵育1h；(10)装载探针：除去步骤(8)和(9)细胞培养板中的细胞培养基，每孔加入终浓度为10μmol/L的2',7'‑二氯荧光黄双乙酸盐荧光探针100μL，37℃、5vt％CO2培养箱中孵育1h；(11)样品测定：除去步骤(10)细胞培养板中的液体，用磷酸缓冲盐溶液PBS洗3次，去除未进入细胞内的2',7'‑二氯荧光黄双乙酸盐荧光探针，用荧光酶标仪于488nm激发波长下测定光度值；(12)活性氧水平计算：根据(11)获得的光度值，按照下列公式计算活性氧水平，以相对荧光强度表征：X＝(Ftest‑Fblank)/(Fcontrol‑Fblank)式中：X——相对荧光强度；Ftest——步骤(11)所得检测样品组多孔平均的光度值；Fblank——步骤(11)所得空白组多孔平均的光度值；Fcontrol——步骤(11)所得细胞对照组多孔平均的光度值。