[发明专利]一种用于甘蔗不同节位侧芽包埋制片方法

摘要

本发明涉及一种用于甘蔗不同节位侧芽包埋制片方法，属于植物组织包埋切片技术领域，包括（1）样品取材固定、（2）软化、（3）脱水、（4）置换、（5）渗透、（6）包埋、（7）修块、（8）切片、（9）展片、粘片、（10）染色等步骤；该方法综合石蜡切片包埋和树脂渗透包埋两种包埋切片方法的特点，整合应用，取长补短，研究开发出新型系统地目前解决了甘蔗侧芽细胞学研究的切片问题，且制出的切片完整，几乎没有破碎，可达到兼顾整体与细节的切片包埋效果。

主权项

1.一种用于甘蔗不同节位侧芽包埋制片方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）样品取材固定：双面刀片割取新鲜采摘甘蔗各茎段上的侧芽纵切，对于稍部开始第一片全展叶片对应节段的芽算1号，按照研究需求依次向下切取，分瓶固定，每瓶放入约2mL先前准备好的2.5%戊二醛固定液；（2）软化：上一步骤约4h后，对于靠近上部的样品选择继续固定，剩余侧芽将固定液抽出，缓冲液清洗三次，每次间隔10min，之后吸去缓冲液，放入4%乙二胺水溶液，4℃下静置8~10h软化，若靠近基部侧芽过硬可适当延长固定时间30~60 min；（3）脱水：将软化后的侧芽或没有经过软化步骤的嫩芽一并用缓冲液清洗三次，每次间隔10min，之后吸去缓冲液，按照酒精浓度逐级提高20%、40%、60%、80%、100%进行脱水，每步20~25min，若当日时间过晚，可在60%酒精后直接转为70%酒精过夜，隔日继续,为保证脱水彻底，100%酒精需要三次，每次20min；（4）置换：a. 对于编号较大的靠近基部的侧芽，采取石蜡切片包埋流程，置换步骤采用二甲苯，先倒去纯酒精，加入二甲苯与酒精体积比1:1的混合液，静置30min，之后倒出换用2:1混合液，30min后换用纯二甲苯；b. 对于较嫩的靠近稍部的侧芽，采取树脂切片包埋流程，置换步骤采用环氧丙烷，先倒去纯酒精，样品瓶内加入环氧丙烷与酒精体积比1:1的混合液，静置10min，之后倒出换用2:1混合液，10min后换用纯环氧丙烷，每10min更换一次纯环氧丙烷，重复三次；（5）渗透：a. 对于石蜡步骤的，此为渗蜡过程，上一步的纯二甲苯，加入熔化的石蜡，温度为65~75℃，处理时间20~30min，更换熔化的石蜡，再处理20~30min，得到浸蜡的侧芽组织；b. 对于树脂包埋步骤的而言，将每一样品瓶内环氧丙烷限制体积为1mL，然后滴加0.2mL环氧树脂，混匀，静置2h，之后每小时滴加0.2mL树脂，逐级提高树脂浓度三次过后，吸去一半混合液，等比例加入另一半纯树脂，混匀静置3h，换纯树脂12h渗透，全过程至于低速摇床轻轻震荡以促进包埋剂渗透；（6）包埋：采用专门设计的可分离式包埋板；a. 石蜡切片而言，使用加高板；b. 树脂切片而言，使用基本板；（7）修块：轻微地将侧芽样品周边一点多余的石蜡或树脂磨去；（8）切片：石蜡包埋块而言，底座与粘木块粘合便可直接进行切片，切片厚度8μm；树脂包埋流程的样品块，其底座与基座树脂粘合便可使用玻璃刀上超薄切片机进行切片，切片厚度1μm；（9）展片、粘片：a. 石蜡包埋的样品在切出片子以后，使用毛笔将包含样品的蜡带轻轻挑起，放在预先洗好并滴加数滴蒸馏水的载玻片上，50℃展片，烤片30min直至切片紧密贴合载玻片， 随后置入纯二甲苯脱蜡缸内静置十分钟脱去石蜡，镊子轻轻拿出脱蜡后的载玻片，依次置于100%、90%、70%、50%、30%、10%酒精进行置换，最后载玻片滴加蒸馏水进行润洗，烤片待染色；b. 对于树脂切片而言，直接将超薄切片机切好的1μm厚的片子使用专用工具从水槽内挑出置于数滴蒸馏水的载玻片上，70℃烤干即可；（10）染色石蜡切片按照常规方法番红固绿复染，亦可使用树脂切片常用的TBO染色剂；树脂切片采用复染法，将上一步粘好的载玻片置于烤片台上，40℃，分别使用1%番红处理1min，洗净后0.5%TBO处理1min，最后0.5%甲基紫处理，蒸馏水洗净后烤片。