[发明专利]建立脓肿分枝杆菌RUO数据库和构建亚型的超级图谱的方法

摘要

本发明公开了一种建立脓肿分枝杆菌RUO数据库和构建亚型的超级图谱的方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤1：脓肿分枝杆菌菌株收集和DNA抽提；步骤2：基因文库制备和illumina HiSeq测序；步骤3：基因组建立与系统进化树构建；步骤4：样本准备和对菌株的检测；步骤5：准确性的确认。本发明通过分析明确脓肿分枝杆菌亚种；通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测亚种信息，建立RUO数据库和构建出的超级图谱，并通过菌株盲测检验其敏感性和特异性，制定用于亚种层面实验室鉴定的操作流程及诊断标准，并加入微生物标准体外诊断流程的工作链，提高了各微生物实验室对脓肿分枝杆菌亚型鉴定的效率。

主权项

1.建立脓肿分枝杆菌RUO数据库和构建亚型的超级图谱的方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤1：脓肿分枝杆菌菌株收集和DNA抽提1‑1、脓肿分枝杆菌菌株的收集收集脓肿分枝杆菌菌株300株，菌株由痰标本和肺泡灌洗液中分离并收集；从患者处获得的检测样本在经过NaOH简化处理后，被接种到斜面罗氏培养基上，生长出的菌落在显微镜下确认为抗酸杆菌；接下来，筛选出的阳性菌落转接种于改良罗氏培养基上，并在37℃条件下培养3至7天；1‑2、DNA抽提将10微升生长在罗氏培养基上的菌环转移到含有1毫升TE和玻璃念珠的离心管中；将离心管置于漩涡振荡机上振荡10分钟使细菌充分悬浮；吸取400微升的细菌悬液至新的离心管中，加入溶菌酶至终浓度1mg/ml，在温度为37℃的环境下过夜；加入70微升十二烷基硫酸钠和10微升蛋白分解酶，在温度为65℃的环境下孵育20分钟，加入100微升十六烷基三甲基溴化铵和氯化钠的混合物，然后迅速加入100μ微升氯化钠；吹打悬液至牛奶状，然后在温度为65℃的环境下孵育10分钟；加入750微升氯仿‑异戊醇的混合液，氯仿和异戊醇的体积比为24:1；漩涡振荡，室温13000转离心5分钟；吸取上清至新的离心管中，加入0.6倍体积的异戊醇，在‑20℃孵育20分钟，然后13000转离心15分钟；弃上清，用乙醇洗涤，13000转离心5分钟；用200微升TE溶解沉淀，使用微量分光光度计对DNA进行定量，OD260/280值在1.8～2.0区间，浓度>6ug的DNA用来扩增使用；步骤2：基因文库制备和illumina HiSeq测序至少3μg DNA用来双末端测序的文库制备，据标准的基因DNA文库制备流程，400bp长度的DNA片段用来双末端测序；利用样品处理系统将DNA剪切成需要的DNA小片段；然后对DNA片段的3’末端添加一个“A”，两端加接头；DNA片段可以通过凝胶电泳提纯，并且通过PCR扩增以达到上样量；最后，对定量的Illumina双末端文库进行Illumina Hiseq测序；步骤3：基因组建立与系统进化树构建计算实验菌株与标准菌株之间的基因差异；菌种的系统生成树则应用非加权组平均法构建而成；通用标准株序列ATCC19977、CIP18297和CIP108541作为脓肿分枝杆菌亚型的参照序列，而H37Rv则作为其他菌种的参照序列；步骤4：样本准备和对菌株的检测吸取1微升含分枝杆菌的罗氏培养基至含有800微升乙醇和250微升玻璃念珠的微量离心管中；将混悬液转移至新的离心管中，13000转离心5分钟；移除上清，干燥10分钟，用10微升甲酸溶解沉淀，室温孵育2到5分钟；加入10微升乙腈，10000转离心3分钟；吸取1微升上清液至目标板上，充分干燥，并用1微升CHCA(α‑氰基‑4‑羟基肉桂酸)基质液覆盖；每一块样本板在进行检测之前，都提前使用大肠杆菌的标准株进行仪器参数校准和器械调整；在收集到质谱图信号后，数据即由收集站传输至分析系统，数据由此以峰值信号的形式展现出来；收集到的质谱图数据与RUO数据库进行比对后，生成菌种的鉴定结果；在收集到的临床菌株质谱数据中，经过挑选的40株脓肿亚种和20株马赛亚种的图谱数据分别按照亚种分组并输入RUO数据库中；在数据库原有的微生物分类树中的脓肿分枝杆菌下新建了2个亚种的文件夹，并分别将导入的质谱数据加入新建的文件夹中；随后，分别在2个亚种间，挑选出40个100％出现在亚种图谱数据之内的峰值信号，以此为基础创建了2个亚种的超级图谱，所有新导入的图谱数据和新构建的超级图谱都被激活以用于随后的鉴定工作；步骤5：准确性的确认更新后的数据库，包括了新导入的质谱图数据组和2个新创建的超级图谱，准确性的评估由余下的240株临床菌株的盲测完成；此300株临床菌株样本，包括已导入数据库的60株和240株盲测菌株，都通过WGS鉴定到亚种层面。