[发明专利]一种高通量酶传感器及检测人体尿液中尿素的方法

摘要

本发明涉及一种基于新型高通量酶传感器的尿素检测方法。96孔微孔板(microplate)的密封板（robolid）作为酶固定化的载体。脲酶固定化采用海藻酸钠‑壳聚糖为基质的包埋法，与多聚赖氨酸（PLL）‑Ba²⁺涂层预处理的形成“egg‑box”结构的海藻酸钡凝胶，从而制备三维高通量酶传感器。酶固定化的robolid板与microplate的组合实现了每个微孔液体密封的多样品的高通量检测（见图1）。制备的酶传感器与微孔板中的样品溶液形成“robolid板‑脲酶‑尿素样品”的夹心结构，通过简单翻转该夹心结构来实现酶反应的启动和停止，简便、高通量地定量检测尿素。与现有尿素检测技术相比，检测平台的整个制备过程和检测过程操作简便、低成本、高通量。尿素浓度与405nm波长下的吸光度正相关，可定性定量检测尿素。此外，商业化的robolid和固定化脲酶robolid可重复使用，性价比高，有益于临床实践和推广。

主权项

1.一种高通量酶传感器的制作方法，其特征是具体步骤如下：1) Robolids板预处理将商品化Robolid密封板96个硅胶微柱，直径5mm/柱，高5mm/柱，密封盖在每孔含有50 uL 0.01%w/v多聚赖氨酸PLL溶液的96‑微孔板上，倒置使Robolid每个微柱表面被PLL溶液覆盖，室温下培育30 min， PLL与微柱的硅羟基结合共价吸附到Robolids表面，移走微孔板，用磷酸缓冲溶液清洗Robolid板2次，室温干燥2 h；使用96通道移液器，在上述处理好的Robolid密封板的每个硅胶微柱上同时滴加30 uL 0.2 M BaCl2，室温干燥过夜；2) 脲酶的固定① 使用96通道移液器在PLL‑BaCl2处理好的Robolids板上同时滴加10 uL 2% 海藻酸钠‑7mg/mL脲酶混合液，之后将其密封盖在已含有100 uL/孔 0.1 M BaCl2溶液的96微孔板上，倒置，在12℃的恒温箱中凝胶化2 h，然后移走微孔板，用磷酸缓冲溶液洗海藻酸钡凝胶2次；② 将上述脲酶固定的robolid板密封在已含有100 uL/孔 2%壳聚糖溶液pH 5.0的微孔板上，倒置，在12℃的恒温箱中培育30 min，使壳聚糖带正电荷的离子和海藻酸钠带负电荷的离子通过静电吸附连接，在海藻酸钡凝胶酶球的表面形成一层聚电解质复合物，减少酶的泄漏，移走微孔板，用磷酸缓冲溶液洗海藻酸钡凝胶3次，并在 4‑8 ℃保存。