[发明专利]一种测定土壤中酸性磷酸酶活性的方法

摘要

本发明公开了一种测定土壤中酸性磷酸酶活性的方法，本方法设置了多组样品和对照，并使其在30℃恒温培养45‑60min后，加入对硝基苯磷酸二钠溶液后，再加入NaOH溶液终止反应，利用其在土壤酸性磷酸酶的催化下水解生成对硝基苯酚、加入NaOH溶液终止反应后显色的特性，通过405nm比色测定酶促反应后所生成的对硝基苯酚的量，来表征酸性磷酸酶的活性。该方法包括准备原料、测量土壤干重、制备粗酶液、测定样品和对照组的Abs以及计算土壤中酸性磷酸酶活性这几个步骤，具有试剂种类少、用量小，操作简单，耗时短，重现性良好且测定快速而准确的优点。

主权项

一种测定土壤中酸性磷酸酶活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：1）准备原料：一份新鲜土壤，pH在4.8~5.2之间的醋酸盐缓冲液，浓度为5.0~5.1umol/ml、作为底物的对硝基苯磷酸二钠溶液，浓度为38~41mg/ml的NaOH溶液；2）在新鲜土壤中取一份土壤样品A，称量并记录鲜重，然后将其烘干至恒重后，称量并记录干重，由此计算得到该新鲜土壤的含水率；再在该新鲜土壤中取一份1~5g重的土壤样品B，称量并记录其鲜重；3）在土壤样品B中加入40ml的醋酸盐缓冲液，搅拌均匀，得到粗酶液，测量并记录其体积，继续搅拌，保持粗酶液处在混合均匀的状态；4）取一块96孔酶标板，记为酶标版A，在酶标版A中设置3~6组样品和对照；所述每组样品中都移取了100ul混合均匀的粗酶液和150ul底物作为培养液；所述每组对照均包括一个底物对照和一个粗酶液对照，所述底物对照都移取了150ul底物和100ul醋酸盐缓冲液作为培养液，所述粗酶液对照都移取了100ul混合均匀的粗酶液和150ul醋酸盐缓冲液作为培养液；5）将步骤4）中装好培养液后的酶标板A置于30℃的培养箱中恒温培养45~60min；6）先取一个干净且无色透明的96孔酶标板，记为酶标板B，用酶标仪于405nm波长处比色，检测到酶标板B每孔对应的Abs，记为空白对照Abs；然后取出培养结束后的酶标板A，分别移取100ul的样品和对照的上清液至酶标板B上对应的孔位，并分别加入10ul的NaOH溶液终止反应，最后置入酶标仪于405nm波长处比色，得到样品Abs、底物对照Abs和粗酶液对照Abs；7）计算OD值：所述OD=（样品Abs‑空白对照Abs）‑[（底物对照Abs‑空白对照Abs）+（粗酶液对照Abs‑空白对照Abs）]，其中，每组样品Abs和对照Abs所减去的空白对照Abs，都是与其在酶标板A中的孔相对应的酶标板B中的孔的空白对照Abs；所述OD为样品吸光度减去对照吸光度后的吸光度；按照此步骤可计算出其余样品的OD值；8）计算得到酸性磷酸酶活性：酶活性(umol·h‑1·gDOM‑1)=（OD×0.25×V）/（EC×h×m×0.1）m=m鲜×(mA干/mA鲜)其中，m为土壤样品B的干重，单位为g；m鲜为土壤样品B的鲜重，单位为g；mA干指样品A的干重，单位为g，mA鲜指样品A的鲜重，单位为g；0.25是指酶标板单孔培养液体积为0.25ml；V为粗酶液体积，单位为ml；EC为消光系数；h为培养液在培养箱中培养的时间，单位为小时；0.1是比色所取上清液的体积0.1ml。