[发明专利]一种萨能奶山羊胎儿成纤维细胞miRNA的筛选与鉴定方法

摘要

本发明公开了一种萨能奶山羊胎儿成纤维细胞miRNA的筛选与鉴定方法，该方法包括以下步骤萨能奶山羊胎儿成纤维细胞的获得；RNA提取；文库构建及高通量测序；数据处理。本发明通过高通量测序，获得16395039total_reads，取出冗余数据后获得clean_reads16150181，其中Unique sRNAS 205857。生物信息学分析获得已知miRNA 44条，候选新miRNA247条。已知miRNA靶基因数量5401，靶基因位点数为6069；候选miRNA靶基因数量8401，靶基因位点数位10832。

主权项

一种萨能奶山羊胎儿成纤维细胞miRNA的筛选与鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、萨能奶山羊胎儿成纤维细胞的获得：选取5只奶山羊做同期发情，与最后一次配种30天B超检查妊娠状况，选成功妊娠并与40‑45天通过手术法无菌取出胎儿，用含双抗PBS冲洗三遍，放入无血清培养基快速带回实验室；在细胞室内无菌除去头、四肢、内脏，剩余皮肤组织酒精冲洗三遍，PBS冲洗三遍，然后剪成1mm3小块贴在细胞培养皿进行培养，每三天换一次培养基，待细胞铺满90％时消化传代，并作生长曲线及核型分析；步骤2、RNA提取：取对数生长期的细胞用trizol法提取RNA，该实验用到的所有物品包括1000mL、200μL、10μL tip头、枪头盒、Enpendoff管必须用0.1％的DEPC水或无RNA酶水浸泡6h以上或直接过夜，包装好后高压灭菌20‑30min，65℃烘干备用；用到的所有研钵、玻璃器皿、金属器械用锡箔纸包装好后放于180℃烘箱中烘烤8h以上，自然降温备用，提取的总RNA经微量分光光度计检查纯度及浓度，合适以后送华大基因进行高通量测序；步骤3、文库构建及高通量测序取上述总RNA经PAGE胶纯化、反转录，然后以HiSeq2000为测序平台进行高通量测序构建cDNA文库；步骤4、数据处理萨能奶山羊胎儿成纤维细胞样品在HiSeq2000平台测序后得到冗余数据，对该原始数据首先要进行去低质量序列，去接头序列以及去污染序列处理，获得干净序列即clean reads，然后再进行下一步生物信息学分析；将获得的clean reads与绵羊全基因组数据库进行blast比对，用SOAPv1.11软件分析序列表达差异及分布情况，为了使每个unique sRNA有唯一的注释，我们采用如下优先规则：rRNAetc>known miRNA>repeat>exon>intron，由于rRNAetc是经Genbank数据库和Rfam数据库比对获得，实验规定两个数据库间的优先顺序为Genbank>Rfam，没有比对上任何注释信息的sRNA用unann表示；为进一步分析候选miRNA二级结构，用Mfold3.2软件和RNAfold在线软件预测新miRNA颈环结构及最小自由能，用MIREAPv0.2软件再进一步深入分析每一个候选序列，参数设置如下：(1)miRNA序列长度为18‑26nt(2)miRNA参考序列长度为20‑24nt(3)Drosha/Dicer酶切位点最少为3个(4)miRNA在参考序列上最大拷贝数为20(5)miRNA前体允许的最大自由能为200kcal/mol(6)miRNA和miRNA*之间最大空格数为35(7)miRNA和miRNA*之间最小配对数为14(8)miRNAand miRNA*之间最大凸环为4。