[发明专利]构建PKHD1基因突变的测序文库的方法和试剂盒及其用途

摘要

本发明提供了高通量测序技术构建PKHD1基因突变的测序文库的方法和试剂盒及其用途。本发明的构建PKHD1基因突变的测序文库的方法包括以下步骤：第一轮扩增；消化引物；第二轮扩增；纯化回收所有DNA条带；测序；分析。

主权项

一种构建PKHD1基因突变的测序文库的方法，包括以下步骤：第一轮扩增：采用包括由与ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO:21)和GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO:22)中的一者的全部序列或其3`端开始13个以上连续脱氧核糖核苷酸构成的序列相同的序列和PKHD1基因各个外显子的正向特异性扩增引物序列串联连接组成的第一轮正向扩增引物以及由与ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO:21)和GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO:22)中的另一者的全部序列或其3`端开始13个以上连续脱氧核糖核苷酸构成的序列相同的序列和PKHD1基因各个外显子的反向特异性扩增引物序列串联连接组成的第一轮反向扩增引物的第一轮扩增引物的组合对各样本的PKHD1基因的一个或多个外显子进行扩增；消化引物：用单链消化酶消化第一轮扩增产物中剩余的引物和引物二聚体；第二轮扩增：以第一轮扩增的产物为模板，采用由与选自D5接头引物序列和N7接头引物序列中一者相同的第二轮正向扩增引物以及与选自D5接头引物序列和N7接头引物序列中另一者相同的第二轮反向扩增引物组成的第二轮扩增引物的组合进行扩增，其中，所述D5接头引物序列选自SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:8中，所述N7接头引物序列选自SEQ ID NO:9～SEQ ID NO:20中，其中，所述第二轮扩增引物的组合包括选自由D501～D508(SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:8)中之一和N701～N712(SEQ ID NO:9～SEQ ID NO:20)之一组成的标签引物序列的一对或多对，以使各样本可区分；纯化回收所有DNA条带；测序：回收的产物进行定量后，将不同标签的产物按照测序数据量要求混合后进行上机测序；分析：基于每个样本的标签序列，将获得的测序结果与样本一一对应，以及根据每个基因的引物序列，将序列对应到样本的每个基因上。