[发明专利]基于三柱二维液质联用法测定肉制品中残留磺胺类药物的方法

摘要

本发明公开了基于三柱二维液质联用法测定肉制品中残留磺胺类药物的方法，它通过配制样品溶液、线性溶液、空白溶液及加标回收试验样品溶液，利用三柱二维液质联用法和内标法，利用在线柱切换液相‑质谱联用技术，实现磺胺类药物残留的在线净化目的，大大提高了检测效率，降低了实验人员的劳动强度，解决了传统分析技术多种磺胺类药物操作繁琐的前处理方法、样品检测周期长、手工预处理的杂质干扰大、重现性难以保证以及多种磺胺类药物同时分析时很难满足待测药物均取得很好的定性定量效果的问题，能提升兽药残留的检测能力，为分析决策提供先进技术支撑。

主权项

1.基于三柱二维液质联用法测定肉制品中残留磺胺类药物的方法，其特征在于包括如下步骤：1）混合标准品工作溶液的配制：分别精密移取0.1mL 1.0mg/mL的各磺胺类药物储备液至10mL容量瓶中，用甲醇定容，再精密移取1 mL混合液至另一10mL容量瓶中，用甲醇定容，制成1 mg/L的混合标准品工作溶液，于4℃下保存备用；2）同位素内标工作溶液的配制：精密移取0.1 mL 1.0mg/mL的内标储备液至10 mL容量瓶中，用甲醇定容，再精密移取0.1 mL定容的容量瓶中内标储备液至50 mL容量瓶中，用甲醇定容，制得20 ng/mL的内标工作溶液，于4℃下保存备用；3）样品溶液的制备：取待测肉制品，置50 mL高速离心管中，精密加入步骤2）得到的同位素内标工作溶液和复合溶剂，高速匀浆1‑3 min，于3500‑4500 r/min离心4‑6 min，取上清液15 mL氮气吹干，残渣用10%甲醇水溶液复溶，制得样品溶液备用；4）线性溶液的制备：称取不含磺胺类药物的肉制品，置50 mL高速离心管中，精密加入复合溶剂，高速匀浆1‑3 min，于3500‑4500 r/min离心4‑6 min，取上清液15 mL氮气吹干，残渣用10%甲醇水溶液复溶，制得空白基质溶液，精密吸取不同量的步骤1）制得的混合标准品工作溶液和相同量的步骤2）制得的同位素内标工作溶液，由空白基质溶液稀释得到各磺胺药物浓度分别为2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL，内标浓度均为2 ng/mL的线性标准溶液，供色谱测定；5）空白溶液的制备：取不含磺胺类药物的样品，置50 mL高速离心管中，精密加入步骤2）得到的同位素内标工作溶液和复合溶剂，高速匀浆1‑3 min，于3500‑4500 r/min离心4‑6 min，取上清液15 mL氮气吹干，残渣用10%甲醇水溶液复溶，制得空白溶液，供色谱测定；6）加标回收试验样品溶液的制备：取不含磺胺类药物的样品，置50 mL高速离心管中，精密加入不同量的步骤1）制得的的混合标准品工作溶液，获得检出限为1ng/mL、定量限为2ng/mL、低、中、高不同水平浓度分别为5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL的加标试验样品，再向该加标试验样品中精密加入100µL步骤2）制得的同位素内标工作溶液，精密加入15‑25 mL复合溶剂，高速匀浆1‑3 min，于3500‑4500 r/min离心4‑6 min，取上清液15 mL氮气吹干，残渣用10%甲醇水溶液复溶，制得加标回收试验样品溶液，供色谱测定；7）用三柱二维液质联用法测定样品溶液、线性溶液、空白溶液及加标回收试验样品溶液a 测定：进样过程：由自动进样器分别吸取5μL样品溶液、线性溶液、空白溶液及加标回收试验样品溶液注入色谱仪中，以三柱二维液质联用法，测定样品溶液中的目标化合物峰面积、内标化合物峰面积；线性溶液中目标化合物峰面积、内标化合物峰面积；加标回收试验样品溶液中目标化合物峰面积、内标化合物峰面积，空白溶液在目标化合物出峰处无干扰，标准工作溶液及试样溶液中待测组分的响应值均应在监测器的线性范围之内；b 曲线方程斜率、曲线方程截距的计算以线性溶液中的目标化合物峰面积比内标化合物峰面积定量，得到曲线方程A=aC+b，式中C为溶液中目标化合物残留量，单位为ng/mL；A为目标化合物峰面积比内标化合物峰面积比；a为曲线方程斜率；b为曲线方程截距，根据线性溶液的浓度、测出的线性溶液中目标化合物峰面积、内标化合物峰面积，采用拟合法，计算得出a和b；c 结果分析：样品溶液中未知组份的保留时间分别与线性溶液中的目标化合物在同一色谱柱上的保留时间相比较，样品中某组份的两组保留时间与线性溶液中某一磺胺类药物的两组保留时间的绝对值在0.05min内，认定为该磺胺类药物，样品溶液中的目标化合物残留量浓度C，其单位为ng/mL，计算公式如下：C=(A‑b)/a式中：A为样品溶液中的目标化合物峰面积比内标化合物峰面积；a和b由步骤b计算得到；d结果验证：加标回收试验样品溶液按步骤c计算出实际的目标化合物残留量浓度C，与其理论的目标化合物残留量浓度C相比较，计算其平均回收率，平均回收率为60‑120%，证明该检测方法可行；所述三柱二维液质联用法如下：首次利用凝胶色谱的体积排阻原理，使大分子的基质干扰物质不经保留直接洗脱，小分子的目标化合物在色谱柱上保留时间较长，实现目标化合物与基质的分离，去除基质干扰；通过水相凝胶柱将基质干扰物分离后，二维色谱系统进行切换，将目标化合物保留在富集柱上，当目标物完全转移到富集柱后，二维色谱在一次切换至初始状态，同时目标物在第二维色谱柱上进行分离分析，通过在线柱切换液相‑质谱联用技术实现磺胺类药物残留的在线净化；所述色谱条件如下：1）一维液相条件：色谱柱：Agilent Bio SEC‑5 5μm，150Å，4.6×150mm，流动相：pH为7.4的磷酸盐缓冲液，等度洗脱，磷酸盐缓冲液 取磷酸二氢钾1.36g，加0.1mol/L 氢氧化钠溶液79mL，用水稀释至200mL得到，流速：0.35mL/min，富集柱：XBridge C8 Direct Connect HP 10μm；2）二维液相条件：色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱 2.1×50 mm，1.7μm，流动相：A相：0.1 %甲酸水，B：0.1 %甲酸甲醇，梯度洗脱， 柱温：25 ℃，进样量：5 μL，3）质谱条件：质谱仪：三重四级杆串联质谱仪，离子源：电喷雾离子源，扫描方式：正离子扫描，检测方式：多反应监测，脱溶剂温度：500℃，源温度：150℃，脱溶剂流速：800L/hr，锥孔流速：150L/hr。