[发明专利]用于高丛蓝莓体细胞胚间接再生的培养基及培养方法

摘要

本发明涉及植物的组织培养领域，旨在提供一种用于高丛蓝莓体细胞胚间接再生的培养基及培养方法。该方法包括：配制四种培养基；在无菌操作条件下，取高丛蓝莓无菌试管苗带叶柄的茎段；进行愈伤组织低温弱光液体浅层培养后，进行蓝莓胚性愈伤组织半凝固培养基低温、黑暗分化增殖培养；蓝莓胚状体固体培养基全光、常温分化成苗培养后，再进行蓝莓生根苗培养。本发明降低了愈伤组织诱导过程中的非胚性愈伤组织的增殖速度，减少了高温和长期不继代引起的褐变风险。采用的四种细胞分裂素低浓度配合使用，较好的维持了胚性愈伤组织的愈伤组织状态，有利于其在诱导成功后的增殖；生根苗不粘有培养基和其他基质，移栽效率较高，显著降低了人工成本。

主权项

1.一种高丛蓝莓体细胞胚间接再生的培养方法，其特征在于，包括下述步骤：（1）按下述配方配制用于高丛蓝莓体细胞胚间接再生中不同培养阶段的培养基；（1.1）高丛蓝莓愈伤组织碳饥饿液体诱导培养基：在改良 1/2MS 基 本 培 养 基 中 添 加ZT 0.5‑1.0mg/L、TDZ0.1‑0.25mg/L、2‑ip 0.25mg/L和CPPU 0.75mg/L，继续添加蔗糖5‑10 g/L，不加琼脂，调节pH为5.0；（1.2）高丛蓝莓胚性愈伤组织诱导及增殖半凝固培养基：在改良1/2MS基本培养基中添加ZT 1mg/L 、TDZ0.2mg/L、2‑ip 0.5mg/L和CPPU 1. 5mg/L，继续添加蔗糖30g/L，琼脂 3‑5g/L，调节pH 为 5.0；（1.3）高丛蓝莓体细胞胚的成熟分化、成苗再生的有机物培养基：在改良1/2MS基本培养基中添加ZT 1‑2.0mg/L和IBA 0.1mg/L，继续附加蔗糖20g/L、椰乳100mg/L、AC 0.5g/L、琼脂 5‑7g/L，调节pH 为 5.0；（1.4）高丛蓝莓分化苗的生根培养基：在改良1/6 MS 基本培养基中添加IBA 1.0mg/L、蔗糖3.5g/L、AC 0.5g/L，不加琼脂，调节pH为5.0；（2）选材与处理：在无菌操作条件下，取增殖旺盛的高丛蓝莓无菌试管苗，将其上部幼嫩部分剪切成长度为1cm、带叶柄的茎段；（3）愈伤组织低温弱光液体浅层培养：将所述高丛蓝莓愈伤组织碳饥饿液体诱导培养基分装到200ml的三角瓶中，每瓶10ml，以塑料透气膜扎口，作为液体浅层培养基；在无菌操作条件下，将10株幼嫩部分的茎段接入液体浅层培养基，在温度 18±2 ℃、光照强度 1000±100 lx，光照时间 12 h/d的条件下连续培养3个月；培养材料不进行继代转接，经培养生成愈伤组织材料；（4）蓝莓胚性愈伤组织半凝固培养基低温、黑暗分化增殖培养：将所述高丛蓝莓胚性愈伤组织诱导及增殖半凝固培养基分装到9×9cm的培养皿中，在无菌操作条件下，将步骤（3）中获得的愈伤组织材料切割分离，并挑选呈现黄绿色的愈伤组织；剔除残存的茎段、出芽以及褐变的部分，接种于高丛蓝莓胚性愈伤组织诱导及增殖半凝固培养基；继续在温度 18±2℃，全黑暗条件下培养3个月，每3周继代一次，每次继代继续挑选呈现黄绿色、松散、易碎的愈伤组织继续继代培养，获得胚性愈伤组织，用于继续继代增殖；（5）蓝莓胚状体固体培养基全光、常温分化成苗培养：将所述高丛蓝莓体细胞胚的成熟分化、成苗再生的有机物培养基分装于容量为200ml以上的三角瓶中，挑选步骤（4）中获得的增殖旺盛、组织质地松散且未褐变的胚性愈伤组织，接种于有机物培养基中；在温度 25±1℃、光照强度 2000±100 lx的条件下培养3个月，每4周继代一次，每次挑选分化出芽部分与愈伤分开继代接种，获得长度和粗度符合预期的蓝莓芽苗；（6）蓝莓生根苗培养：取12×12cm培养皿，在底部先垫入脱脂棉，然后覆盖大小相近的滤纸；将高丛蓝莓分化苗的生根培养基分装于培养皿中，分装量以浸湿脱脂棉和滤纸为准；剪取健壮的蓝莓芽苗置于培养皿中，每个培养皿接种15株；在温度 25±1℃的条件下，黑暗培养7天；再置于光照强度 2000±100 lx条件下，培养21天，获得蓝莓生根苗；所述改良1/2MS 基本培养基的具体配方为：大量元素：NH4NO3 825 mg/L，KNO3 950 mg/L，CaCl2·2H2O 220 mg/L，MgSO4·7H2O 185 mg/L，KH2PO4 85 mg/L；微量元素：KI 0.83 mg/L，H3BO3 6.2 mg/L，MnSO4·4H2O 22.3 mg/L，ZnSO4·7H2O 8.6 mg/L，Na2MnO4·2H2O 0.25 mg/L CuSO4·5H2O 0.025 mg/L，CoCl2·6H2O 0.025 mg/L， FeSO4·7H2O 27.8 mg/L，Na2‑EDTA·2H2O 37.3 mg/L；有机成分：肌醇 100 mg/L，烟酸 0.5 mg/L，盐酸吡哆醇 0.5 mg/L，盐酸硫胺素 0.5 mg/L，甘氨酸 2 mg/L ；所述改良1/6 MS 基本培养基的具体配方为：大量元素：NH4NO3 275 mg/L，KNO3 317 mg/L，CaCl2·2H2O 73 mg/L，MgSO4·7H2O 62mg/L，KH2PO4 28.3 mg/L；微量元素：KI 0.83 mg/L，H3BO3 6.2 mg/L，MnSO4·4H2O 22.3 mg/L，ZnSO4·7H2O 8.6 mg/L，Na2MnO4·2H2O 0.25 mg/L CuSO4·5H2O 0.025 mg/L，CoCl2·6H2O 0.025 mg/L， FeSO4·7H2O 27.8 mg/L，Na2‑EDTA·2H2O 37.3 mg/L；有机成分：肌醇 20 mg/L，烟酸 0.1mg/L，盐酸吡哆醇 0.1 mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，甘氨酸 0.4 mg/L。