[发明专利]一种大量提取质粒的方法及其应用

摘要

本发明公开了一种大量提取质粒的方法及其应用。该质粒提取的方法将GoldenView应用于CsCl质粒提取中的核酸显色，替代传统使用的溴化乙锭（EB）。与现有的应用EB进行CsCl质粒提取技术相比，应用GoldenView提取质粒的量略高，且提取质粒中内毒素、蛋白残留均未检出，说明在CsCl质粒提取中应用GoldenView染料可以保证不影响质粒的提取量和提取质量，同时GoldenView还可大幅减轻染料对实验人员的毒性影响，与现有技术相比具有明显的优势。

主权项

1.一种大量提取质粒的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、将含有目的质粒的大肠杆菌接种至400mL TB培养基中，37℃，200rpm培养过夜；然后4℃、6000g离心10min，弃上清，倒置离心管使残余的液体流出；S2、加入预冷至4℃的P1缓冲液至终体积到10mL，震荡重悬使沉淀的细菌均匀分散，所述P1缓冲液包括50mmol/L的Tris‑HCl、10mmol/L的EDTA、100ug/mL的RNase A ，且所述P1缓冲液的pH为8.0；S3、加入20mg的溶菌酶，完全重悬沉淀，室温放置10min，所述溶菌酶为固体，且所述溶菌酶为hen egg white lysozyme；S4、加入20mL新鲜制备的P2溶液，用移液管轻轻混匀直至溶液均一透明，室温放置5min～10min，所述P2溶液包括200mmol/L的NaOH及质量百分含量为1％SDS；S5、加入预冷至4℃的P3溶液10mL，轻轻但完全地震荡混匀数次，直至两个液相不再分离，原有的黄色消失，白色絮状物出现，然后置于冰上10min，所述P3溶液为pH4.8、2mol/L的KAc水溶液；S6、4℃、8000rpm离心10min，弃沉淀，将上清通过四层纱布过滤到量筒中；S7、加入0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温放置10min～15min，置于50mL离心管中；S8、8000rpm离心15min后，将上清弃处干净，回收核酸沉淀；S9、洗涤所述核酸沉淀：在室温下用2mL 70％乙醇涮洗管底及管壁，然后将乙醇倒出并吸干管壁上的液滴，或8000rpm常温离心10min弃上清；敞开离心管管口10min～15min，使剩余的乙醇完全挥发掉；S10、加入7mL 1×TE溶液溶解沉淀，并加入7mL 1×TE溶液冲洗管壁；S11、加入12.5g的氯化铯，溶解混匀；S12、加入10微升的GoldenView核酸染料混匀；S13、将混匀后的溶液转移至超速离心管中，充满离心管并平衡密封；S14、室温下55000rpm离心至少12h或者65000rpm离心4h；S15、离心结束后，将离心管取出并置于锡箔纸包裹的试管架上，在仅有微光的室内，可见离心后的所述离心管具有两条DNA区带，上层区带是染色体和线性DNA，下层为所需的cccDNA；S16、用18号针管小心收集cccDNA，置于50mL离心管中；S17、加入等体积的水饱和异戊醇，盖紧管盖，震荡混合有机相和水相；S18、室温下450g离心3min，使水相和有机相分离，并将上层的所述有机相转移至合适的废液桶中，所述有机相呈粉红色；S19、重复步骤S16～S17的步骤4次～6次，直到水相和有机相均不见绿色；S20、向所述水相中加入2.2倍体积的水和0.6倍体积的异丙醇混匀；S21、室温下8000rpm离心15min，弃上清，并回收核酸沉淀；S22、加入8mL超纯水重悬沉淀，再加入10mol/L醋酸铵溶液至终浓度2mol/L，充分混匀后加入2.5倍～3倍体积、预冷至‑20℃的乙醇，混匀，置于干冰或‑80℃冰箱中，孵育10min；S23、4℃、8000rpm离心10min，弃上清；S24、加入20mL 70％乙醇混合，4℃、12000g离心10min，弃上清；S25、将装有沉淀的离心管置于超净台中风干2min，加入TE溶解，得到质粒。