[发明专利]芽孢杆菌芽孢的纯化方法

摘要

本案涉及芽孢杆菌芽孢的纯化方法，包括：无菌水洗涤，浓缩；重盐洗液洗涤；酶溶液孵育；表面活性剂溶液洗涤；酶抑制剂溶液洗涤；无菌水再次洗涤；置于80℃水浴中灭菌；最终得到的芽孢杆菌芽孢以无菌水混悬，保存。本案在保证制备的芽孢数量的同时，极大提高了芽孢纯度；通过本案纯化方法可有效去除菌体营养细胞、培养基残留物质及破裂营养细胞释放的蛋白酶等活性物质，有效避免上述物质对芽胞的诱导转化；更利于芽孢悬液在水溶液中的长期保存；本工艺操作简单，工艺易于放大，衰减小，重复性好，易于工业化生产。

主权项

1.一种芽孢杆菌芽孢的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：1)无菌水洗涤：将芽孢杆菌芽孢粗品用无菌水在5000rpm、4℃下离心洗涤；并将芽孢杆菌芽孢的浓度调节至10⁵‑10⁸/mL，得到芽孢菌体混合液；2)重盐洗涤：向所述芽孢菌体混合液中加入5‑15倍重量的重盐洗液，混匀，在5000rpm、4℃下离心，去上清，得沉淀一；3)酶溶液孵育：向所述沉淀一中加入酶消化液，悬浮沉淀，调节芽孢浓度至10⁴‑10⁶/mL，37℃水浴加热1h后，在5000rpm、4℃下离心，去上清，得沉淀二；4)表面活性剂溶液洗涤：向所述沉淀二中加入表面活性剂溶液，使芽孢浓度达到10⁴‑10⁶/mL，混匀后，在5000rpm、4℃下离心，去上清，得沉淀三；5)酶抑制剂溶液洗涤：向沉淀三中加入酶抑制剂溶液，混匀后，在5000rpm、4℃下离心，去上清，得沉淀四；6)无菌水洗涤：向所述沉淀四加入无菌水，震荡混匀后，在5000rpm、4℃下离心，去上清，得沉淀五；再次加入无菌水，混匀，置于80℃水浴中灭菌20min，离心；最终得到的芽孢杆菌芽孢以无菌水混悬，保存；其中，所述重盐洗液由1M的KCl、0.5M的NaCl、0.1M的ZnCl₂、0.1M的AlCl₃和无菌水组成；所述酶溶液由50μg/ml的溶菌酶和无菌水组成；所述表面活性剂溶液由0.05wt％的十二烷基硫酸钠和无菌水组成；所述酶抑制剂溶液由50mM的Tris‑HCl缓冲液、10mM的EDTA、2mM的苯甲基磺酰氟和无菌水组成。