[发明专利]一种免提取直接扩增人蛔虫单个虫卵DNA的方法

摘要

一种免提取直接扩增人蛔虫单个虫卵DNA的方法，包括蒸馏水洗虫卵、破碎虫卵、PCR扩增和结果检测四个步骤。本发明通过优化虫卵的破碎方法和PCR扩增体系，可得到稳定性好、扩增效率高的PCR产物，可避免DNA在抽提过程中的损失而造成的扩增失败。本发明得到的扩增产物，能有效地进行下游基因测序和STR扫描，为人蛔虫的分子流行病学、遗传多样性、遗传结构、系统发生学、谱系地理学和古生物学研究提供重要的技术方法，该发明对人蛔虫病的分子诊断和防控也有重要意义。

主权项

一种免提取直接扩增人蛔虫单个虫卵DNA的方法，其特征是包括以下步骤：（1）蒸馏水洗虫卵：用离心管，加入蒸馏水和虫卵，3200rpm漩涡震荡1‑2min后，10000r/min离心2‑5min，弃上清液，反复3次；显微镜下挑取一个虫卵于事先装有研磨球及高纯水的PCR管中；（2）破碎虫卵：将装有研磨球的PCR管于100℃沸水和‑80℃或液氮中交替放置lmin，经过6‑9次的反复充分冻融后，水平放在漩涡震荡仪上3200rpm 震荡10‑15min；（3）PCR扩增：吸取PCR反应液于PCR管中进行扩增；PCR反应液的配方为：Premix Taq Version2.0，上、下游引物各0.2‑0.5 μM，高纯水；反应条件为94℃预变性5分钟，先进行5个循环的高温PCR：94℃变性45秒，53‑55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，再进行30‑35个循环的低温PCR：94℃变性45秒，45‑47℃退火30秒，72℃延伸1分钟，最后72℃延伸7分钟；（4）结果检测：取出少量PCR产物，经凝胶电泳检测，用凝胶成像系统观察结果。