[发明专利]一种电位分辨双肿瘤标志物的电化学发光免疫传感器的制备方法及其应用

摘要

本发明公开了一种电位分辨双肿瘤标志物的电化学发光免疫传感器的制备方法及其应用，特点是包括将氧化石墨烯进行羧基化得到羧基化的氧化石墨烯溶液，然后依次加入偶联试剂、anti‑CA1252和Ru‑NH2得到第一信号单元的步骤；将氮化碳薄膜溶液加入胶体金溶液中得到AuNPs/g‑C3N4溶液；然后加入anti‑SCCA2溶液得第二信号单元的步骤；最后将金电极插入anti‑CA1251和anti‑SCCA1的混合溶液中，然后孵育在含有CA125和SCCA的待测混合溶液中，再置于含有第一信号单元和第二信号单元的混合溶液中孵育即可，优点是操作简单，特异性强，灵敏度和准确率高。

主权项

一种电位分辨双肿瘤标志物的电化学发光免疫传感器的制备方法，其特征在于包括以下步骤：（1）第一信号单元的制备方法a.取30～50 mL 2.0～3.0 mg/mL的氧化石墨烯于三颈烧瓶中，加入5～10 mL溴化氢，常温下搅拌12～15 h，然后加入1.0～2.0 g乙二酸，常温下搅拌4 h，于8000 rpm离心弃去上清液，然后用蒸馏水洗涤至中性，定容至30～50 mL，得到羧基化的氧化石墨烯溶液；b.取200 μL上述羧基化的氧化石墨烯溶液于1.5 mL玻璃瓶中，超声10 min，然后加入200～400 μL偶联试剂，混合均匀，同时滴加0.1～0.2 mol/L盐酸溶液至溶液pH为4.0～6.0，振荡孵育1～3 h，加入1 mL二次水清洗，于8000 rpm离心3次去除上清液后，定容至200～300 µL；然后加入50～100 µL 10‑6～10‑4 U/mL anti‑CA1252溶液和50～100 µL 10‑4～10‑2 mol/L Ru‑NH2溶液，用0.1～0.2 mol/L NaOH溶液调pH为8.0～10.0，继续振荡孵育3～5 h；然后加入50～100 µL 2wt%牛血清白蛋白溶液以封闭非特异性吸附位点，继续孵育1～2 h；再加入蒸馏水离心清洗至中性后，定容至100～200 µL，即得到第一信号单元anti‑CA1252‑ Ru‑NH2@GO‑COOH溶液；（2）第二信号单元的制备方法a．氮化碳薄膜的合成：将三聚氰胺在500～600 ℃下加热3～5 h，真空干燥后，得到氮化碳粉末；取0.8～1.5 g 氮化碳粉末加入到80～120 mL 4～6 mol/L HNO3中，于120～150 ℃下回流24～48小时后，自然冷却至室温，12000 rpm离心弃去上清液，然后用蒸馏水洗涤至中性，超声4个小时，8000 rpm离心半个小时，取上清液，即得到产物氮化碳薄膜溶液；b．将30～70 mL氮化碳薄膜溶液加入到 30～70 mL 胶体金溶液中，室温下搅拌16～24 h，然后于6000～8000 rpm离心半小时后，去除没有连接上的胶体金，取其上清液即得到AuNPs/g‑C3N4溶液；然后取200 μL AuNPs/g‑C3N4溶液于玻璃瓶中，加入30～50 μL 10‑4～10‑6 mg/mL anti‑SCCA2溶液后孵育3～5 h；然后加入50～100 µL 2wt%牛血清白蛋白溶液以封闭非特异性吸附位点，继续孵育1～2 h；加入1 mL二次水清洗，于12000 rpm离心去除上清液后，即得第二信号单元anti‑SCCA2‑AuNPs/g‑C3N4溶液；（3）电化学发光免疫传感器的组装a. 将直径为3～5 mm的金电极依次用1.0、0.3和0.05 μm的Al2O3抛光粉在麂皮上抛光至镜面，用蒸馏水冲洗干净，再依次在乙醇、蒸馏水中超声洗涤，清洗后的电极放入浓H2SO4和H2O2按体积比7:3混合成的混合溶液中浸泡5～10 min，取出洗净，然后在0.5 mol/L 硫酸溶液中用循环伏安扫描处理，扫描速度为50 mV/s，电压范围为‑0.3～1.5 V，持续扫描得到稳定的循环伏安图后，取出用二次蒸馏水洗净待用；b. 将上述预处理过的金电极插入20～30 µL 含10‑6～10‑4 U/mL anti‑CA1251和10‑6～10‑4 mg/mL anti‑SCCA1的混合溶液中，孵育16 h，然后加入50～100 µL 2wt%牛血清白蛋白溶液以封闭非特异性吸附位点，继续孵育1～2 h，用蒸馏水清洗去除剩余的牛血清白蛋白溶液，然后孵育在50～100 µL含有CA125和SCCA的待测混合溶液中，置37 ℃中孵育1～2 h后，清洗；再置于10～20 µL由步骤（1）b所得的anti‑CA1252‑Ru‑NH2@GO‑COOH溶液和步骤（2）b所得的anti‑SCCA2‑AuNPs/g‑C3N4溶液按等体积混合而成的混合溶液中，于37 ℃中孵育1～2 h后，清洗；即得到同时检测CA125和SCCA两种肿瘤标志物的电位分辨双肿瘤标志物的电化学发光免疫传感器。