[发明专利]表达神经退行性疾病保护肽的AAV9-CIP病毒及其制备方法

摘要

本发明公开了一种表达神经退行性疾病保护肽的AAV9‑CIP病毒的制备方法，包括以下步骤：步骤1：设计Myc‑CIP引物，得到Myc‑CIP基因片段；步骤2：得到质粒pCR2.1‑Myc‑CIP；步骤3：得到质粒pEGFP‑C2‑Myc‑CIP；步骤4：得到质粒pAAV‑hSynapsin‑GFP‑Myc‑CIP；步骤5：得到AAV9‑CIP病毒。本发明的目的在于提供一种能在中枢神经系统神经元细胞中特异表达的神经退行性疾病保护肽的AAV9‑CIP病毒，由于CIP能特异抑制神经系统退行性疾病病变过程中产生的神经毒性复合物CDK5/p25,因此本发明建立了能用于神经系统退行性疾病如阿尔兹海默病、帕金森病等的靶向干预治疗CIP病毒，同时本发明还公开了一种表达神经退行性疾病保护肽的AAV9‑CIP病毒的制备方法。

主权项

1.一种表达神经退行性疾病保护肽的AAV9‑CIP病毒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：设计Myc‑CIP引物，以pcDNA3.1‑HisC‑p35为模板通过PCR反应得到Myc‑CIP基因片段；步骤2：将Myc‑CIP基因片段插入到pCR2.1TOPO载体中，通过连接反应得到质粒pCR2.1‑Myc‑CIP；步骤3：将Myc‑CIP基因片段以内切酶从pCR2.1‑Myc‑CIP切出并插入到pEGFP‑C2载体的多克隆位点，得到质粒pEGFP‑C2‑Myc‑CIP；步骤4：将GFP‑Myc‑CIP基因片段从质粒pEGFP‑C2‑Myc‑CIP中切出，替代pAAV‑hSynapsin‑eGFP质粒的eGFP基因片段，得到质粒pAAV‑hSynapsin‑GFP‑Myc‑CIP；步骤5：将病毒表达质粒pAAV‑hSynapsin‑GFP‑Myc‑CIP、腺相关病毒包装质粒pAAV2/9和辅助质粒pHelper共转染到人胚肾293细胞中，转染72小时后收集含有病毒的细胞及培养液，对后者进行纯化分离得到AAV9‑CIP病毒；所述Myc‑CIP基因片段编码MASMQKLISE EDLMCLGEFL CRRCYRLKHL SPTDPVLWLR SVDRSLLLQG WQDQGFITPA NVVFLYMLCR DVISSEVGSD HELQAVLLTC LYLSYSYMGN EISYPLKPFL VESCKEAFWD RCLSVINLMS SKMLQINADP所示Myc‑CIP融合蛋白。