[发明专利]A群脑膜炎球菌荚膜多糖结合疫苗的制备方法

摘要

本发明公开了一种A群脑膜炎球菌荚膜多糖结合疫苗的制备方法，包括制备A群脑膜炎球菌荚膜多糖，及A群脑膜炎球菌荚膜多糖与SPH及破伤风类毒素蛋白的结合，其中，多糖的制备具体为开启A群脑膜炎球菌菌种传代至氯化血红素流脑半综合培养基上，放入二氧化碳细胞培养箱中，36.5℃，8%CO2培养；将培养得到的A群脑膜炎球菌种子接种到种子罐，恒温搅拌通气培养后接种入发酵罐后，恒温36.5℃，深层通气240rpm搅拌培养，培养A群脑膜炎球菌至对数生长期后期或静止期前期，收集上清液；纯化后得到多糖，且苯酚的用量为粗糖的3/4（v/v）。本发明所示优化后的工艺一方面控制A群脑膜炎球菌发酵液中的核酸及蛋白等杂质成分含量较低，另一方面降低苯酚的用量。

主权项

A群脑膜炎球菌荚膜多糖结合疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1）开启菌种及传代：开启A群脑膜炎球菌菌种传代至氯化血红素流脑半综合培养基上，放入二氧化碳细胞培养箱中，36.5℃，8%CO2培养，二代采用半综合固体培养基培养，三代采用流脑半综合液体培养基在恒温振荡摇床中培养；2）接种到种子罐培养：将上述步骤1）培养得到的A群脑膜炎球菌种子接种到种子罐，恒温搅拌通气培养，培养至第五代；3）发酵罐发酵：将上述步骤2）培养得到的A群脑膜炎球菌五代种子接种入发酵罐后，恒温36.5℃，深层通气240rpm搅拌培养，中途补加葡萄糖溶液为A群脑膜炎球菌生产荚膜多糖提供原料，培养A群脑膜炎球菌至对数生长期后期或静止期前期，此时菌浓度达到100‑200亿/mL，甲醛杀菌后去除菌体，收集发酵液上清液；4）一次纯化：加入十六烷基三甲基溴化铵至终浓度1.0g/L，充分搅拌后静置过夜，离心收集多糖，沉淀的多糖用氯化钙溶液搅拌3小时使多糖和十六烷基三甲基溴化铵解离，离心收集上清，上清加入乙醇至终浓度为25%（v/v），2‑8℃静置过夜，离心收集上清，上清加入乙醇至终浓度为75‑80%（v/v），充分振摇使多糖沉淀，静置18小时以上，离心收集沉淀，然后用无水乙醇和丙酮各洗三次，得到粗糖；5）二次纯化：将粗糖溶解于10%饱和中性醋酸钠溶液中，然后按粗糖与苯酚之比为4:3（v/v）的比例加入苯酚溶液，振荡混匀后离心收集上清液，抽提1‑3次至上清液澄清，收集上清液，用超滤膜包超滤去除残余的苯酚及核酸，超滤后的多糖溶液中加入4mol/L NaCl溶液，至NaCl终浓度为0.3mol/L，然后加入95%乙醇至乙醇终浓度为75%（v/v），充分混匀后2‑8℃静置过夜，沉淀多糖，离心收集沉淀，然后依次用无水乙醇、丙酮各洗涤两次；6）A群脑膜炎球菌荚膜多糖的活化和衍生：称取上述步骤5）二次纯化后得到的多糖400mg，溶解于注射用水中，配制成浓度为8mg/mL的溶液，恒温至20℃，调节pH至10.5，加入与多糖等质量的溴化氰，维持pH10.5活化20分钟；调节pH至8.5，加入与多糖溶液等体积、等浓度的SPH，维持pH8.5反应15分钟，反应物经反复稀释超滤浓缩，去掉残余溴化氰，得到多糖‑SPH衍生物；7）结合破伤风类毒素蛋白：在上述步骤6）制得的多糖‑SPH衍生物中加入与多糖等质量的破伤风类毒素溶液，再用注射用水稀释，使多糖终浓度为3mg/mL，混匀后置冰浴中，加入EDAC粉末至终浓度为30mmol/L，维持pH5.5，于2‑8℃反应60分钟，调节pH至7.0、2‑8℃静置10小时，反应物经Sepharose 4FF 凝胶柱分离纯化，收集V0附近的洗脱液，除菌过滤。