[发明专利]一种A群C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法

摘要

本发明公开了一种A群C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法，包括以下步骤：（1）A群C群脑膜炎球菌荚膜多糖制备并纯化；（2）将C群流脑多糖配制溶液，然后在搅拌下加入CDAP，静置后加入ADH反应得到反应物溶液，将反应物溶液透析后得A群C群流脑多糖‑ADH衍生物；（3）将A群C群流脑多糖‑ADH衍生物和破伤风类毒素按质量比为1:1混合，加入EDAC，搅拌反应再透析得反应物，层析法进行纯化，收集外水体积洗脱组份，除菌过滤后得原液；（4）冻干保护即得。本发明有效的避免了避免纯化过程对苯酚的使用，以及制备衍生物过程对溴化氰的使用，以使得整个制备过程无毒伤害，能够减少环境污染，对环境起到一定的保护作用。

主权项

一种A群C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将脑膜炎球菌进行发酵培养并进行杀菌处理，得到已杀菌的培养液；（2）脑膜炎球菌荚膜多糖制备将已杀菌的培养液离心收集上清，再加入十六烷基三甲基溴化铵至终浓度1.0g/L，充分搅拌后静置过夜，离心收集多糖沉淀物，再用氯化钙溶液将多糖沉淀物充分搅拌3‑5小时至多糖和CTAB解离后离心收集上清液Ⅰ，在上清液Ⅰ中加入乙醇至终浓度25%v/v，在2‑8℃下静置过夜；再次离心收集上清液Ⅱ，在上清液Ⅱ加入乙醇至终浓度75%v/v，振摇使多糖沉淀下来静置18小时以上，离心收集沉淀，再将沉淀洗净干燥后即得粗制多糖；（3）将粗制多糖溶解于缓冲液A中，粗制多糖的溶解浓度为5～10mg/ml，溶解后的粗制多糖经澄清过滤后，上样于用缓冲液预先平衡好的DEAE‑Sepharose Fast Flow层析柱，收集未吸附的流穿峰，然后上样于以缓冲液B预先平衡好的Capto Adhere层析柱，以缓冲液B作为流动相进行洗脱，收集含有多糖的目标峰，再将收集的多糖溶液以注射用水为超滤液，用超滤膜包进行脱盐，脱盐后的溶液即为A群C群脑膜炎球菌多糖溶液，其中缓冲液A为20mM Tris‑HCl，0.5%脱氧胆酸钠，pH 8.0；缓冲液B为20mM Tris‑HCl，pH 8.0；（4）将5mg/mL的A群C群脑膜炎球菌多糖溶液，在搅拌下加入CDAP，其中A群C群脑膜炎球菌多糖和CDAP的质量比为1:0.5‑1.5，并调混合溶液的pH值范围为9.0‑11.0，静置10‑40min后加入ADH反应15min得到反应物溶液，其中A群C群脑膜炎球菌多糖和ADH的质量比为1:3.5，将反应物溶液透析后得A群C群脑膜炎球菌多糖‑ADH衍生物；（5）将A群C群脑膜炎球菌多糖‑ADH衍生物和破伤风类毒素按质量比为1:1混合，调pH值范围为5.5‑5.7，加入EDAC，并于2‑8℃搅拌反应5‑6h后，再进行透析得反应物，再将反应物用层析法进行纯化，收集外水体积洗脱组份，除菌过滤后得原液；（6）在原液中加入0.2mol/L氯化钠溶液并补加蒸馏水调整混合液的浓度符合注射剂量，再加入冻干保护剂即得A群C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗。