[发明专利]一种纯化牛胎儿骨骼肌组织来源成肌细胞的方法

摘要

本发明公开了一种纯化牛胎儿骨骼肌组织来源成肌细胞的方法，所述方法使用的材料为，牛3月龄胎儿背最长肌组织，所用试剂为马血清、抗快肌肌浆球蛋白重链抗体、胶原酶、胎牛血清、低糖达尔伯克氏改良伊格尔培养基、细胞分选缓冲液、抗血小板源性生长因子受体α抗体。

主权项

1.一种纯化牛胎儿骨骼肌组织来源成肌细胞的方法，其特征在于：所述方法使用的材料为，牛3月龄胎儿背最长肌组织，所用试剂为马血清、抗快肌肌浆球蛋白重链抗体、胶原酶、胎牛血清、低糖达尔伯克氏改良伊格尔培养基、细胞分选缓冲液、抗血小板源性生长因子受体α抗体；所述方法包括以下步骤：步骤一、细胞的分离培养；步骤二、细胞培养；步骤三、细胞的成肌诱导；步骤四、免疫荧光；步骤五、成肌诱导结果观察；所述步骤一具体包括以下步骤：步骤(1)将牛胎儿用75％的酒精和含有双抗的磷酸盐缓冲液冲洗3‑6遍；步骤(2)然后放置于无菌环境中剪破羊膜，取出胎儿，用眼科剪剪开背部皮肤，用眼科剪刀、镊子分离出背部肌肉；步骤(3)用镊子取出2块绿豆粒大小的肌肉组织放入到培养皿中，培养皿里预先加入含有双抗的磷酸盐缓冲液溶液，用磷酸盐缓冲液溶液洗清洗3次除去血细胞；步骤(4)然后转移到EP管中，加入1mL 0.1％Ⅳ型胶原酶，用眼科剪剪碎至肉糜状；步骤(5)将剪碎的组织放入37℃气体恒温摇床中消化45min，期间每15min吹打组织一次；步骤(6)45min后用40μm的细胞过滤网将细胞浆过滤，400rpm离心5min，弃去上清液，加入细胞分选缓冲液悬浮细胞；步骤(7)加入2μL抗血小板源性生长因子受体α抗体后孵育15min，300rcf离心10min；步骤(8)加入1mL细胞分选缓冲液后300rcf离心10min，弃上清，重复一次；步骤(9)吸去上清后加入80μL细胞分选缓冲液，再加入20μL抗兔源免疫球蛋白微珠，混匀后4℃中孵育15min；步骤(10)加入1mL细胞分选缓冲液后300rcf离心10min，弃上清，重复一次；步骤(11)加入500μL细胞分选缓冲液悬浮细胞；步骤(12)将MS分选柱至于磁力架上，将悬浮液加入到准备好的MS分选柱上，收集流下的阴性细胞，冲洗分选柱3次，每次用500μL细胞分选缓冲液，收集流下的液体与第一步合并；步骤(13)将MS分选柱从磁力架上取下置于新的收集管中，加入1mLbuffer后，用活塞快速推入到分选柱中，收集流出的液体即为阳性细胞；所述步骤二具体包括以下步骤：当原代细胞生长聚集至70～80％的时候，吸去旧培养基，并用磷酸盐缓冲液溶液清洗2次，将0.25％胰蛋白酶加入后，放入培养箱中30s，在倒置相差显微镜下观察细胞呈圆形时，用手轻柔敲打培养皿，直到圆形的细胞漂浮后，即刻加入培养基来终止消化反应继续进行，轻柔的吹打细胞，以1:3比例进行传代培养，将细胞放入温度为37℃、CO2含量为5％的恒温培养箱中培养；所述步骤三具体包括以下步骤：当细胞生长状态聚合到100％时，弃掉培养基，用磷酸盐缓冲液清洗2次，加入成肌细胞诱导液开始进行诱导，每3d换一次液；所述成肌细胞诱导液由低糖达尔伯克氏改良伊格尔培养基和体积比为5％马血清组成；所述步骤四具体包括以下步骤：(a)弃掉旧培养基，缓慢加入磷酸盐缓冲液溶液洗涤细胞3次；(b)加入重量比为4％多聚甲醛后，在室温条件下放置15min，磷酸盐缓冲液溶液洗涤3次，每次5min；(c)加体积比为0.1％聚乙二醇辛基苯基醚，室温通透20min，磷酸盐缓冲液洗涤3次，每次5min；(d)加入山羊血清，室温封闭30min；(e)弃掉封闭液后，加预先稀释的抗快肌肌浆球蛋白重链抗体，4℃孵育过夜，空白对照里加入250μL的磷酸盐缓冲液溶液，磷酸盐缓冲液洗涤3次，每次5min；(f)加入预先稀释好的二抗，在室温避光环境条件下孵育1h；(g)避光条件下，磷酸盐缓冲液清洗3次，每次5min；(h)加入用磷酸盐缓冲液按1:1000稀释的4',6‑二脒基‑2‑苯基吲哚，室温避光孵育15min；(i)避光条件下，磷酸盐缓冲液溶液洗涤3次，每次5min，然后加入少量磷酸盐缓冲液；(j)激光扫描共聚焦显微镜下观察成肌诱导的实验结果并拍照；所述步骤五具体包括以下步骤：(I)形态学观察将牛胎儿早期骨骼肌来源细胞的基础培养基换为成肌诱导液后，细胞间相互作用，逐渐开始发生相互融合的现象，随着时间的增长，大部分细胞融合增多，诱导15天，看到形成相互平行和相互交叉的多核肌管，且抗血小板源性生长因子受体α阴性细胞比抗血小板源性生长因子受体α阳性细胞形成的肌管多；(II)免疫荧光采用免疫荧光的方法鉴定成肌细胞特异性标志物快肌肌浆蛋白的表达情况，观察结果显示：细胞加入成肌诱导液的10d后，可清晰的看到肌管的形态，并且表达快肌肌浆蛋白，且可清晰的看到抗血小板源性生长因子受体α阴性细胞组比抗血小板源性生长因子受体α阳性细胞组形成的肌管多。