[发明专利]一种规模化分离纯化重组人源胶原蛋白的方法

摘要

本发明公开了一种规模化分离纯化重组人源胶原蛋白的方法，通过将线性重组蛋白进行初折叠和重折叠，精确控制蛋白分子的空间半径，既有利于微滤和超滤膜孔径的精确选型，又可提高蛋白的回收率，联合应用微滤和超滤，分别去除大分子和小分子杂质，同时超滤实现蛋白浓缩，减轻了后期凝胶柱层析分离的负荷，再通过加入尿素，实现重组蛋白折叠后的解旋，避免了有害物的残留。本发明方法获得的重组人源胶原蛋白，纯度可达99％，回收率高于65％，方法操作简便，显著降低了重组人源胶原蛋白的规模化生产的成本，特别适合工业化生产。

主权项

1.一种从巴斯德毕赤酵母菌Pichia pastoris发酵液经离心收集得到的上清液中规模化分离纯化重组人源胶原蛋白的方法，其特征在于，具体步骤如下：将巴斯德毕赤酵母菌Pichia pastoris发酵液离心，收集上清液，上清液先在pH≥9的第一缓冲溶液中进行初折叠，再在通入足量空气的、9＜pH≤11的第二缓冲溶液中进行充分的重折叠，折叠后通入氮气稳定蛋白，之后微滤去除蛋白溶液中的大分子杂质，超滤去除小分子杂质，同时进行蛋白质的浓缩，在浓缩液中加入4～8M的尿素使重折叠蛋白解旋，解旋液经凝胶柱层析纯化，冷冻干燥后得到重组人源胶原蛋白，/n其中，所述的巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris的保藏编号为CGMCC No.5021；/n所述的第一缓冲溶液包含以下组分：1.5M尿素，0.4M精氨酸，5～80mM小分子碱，8mM乙二胺四乙酸；/n所述的第二缓冲溶液包含以下组分：1.5M尿素，25mM半胱氨酸，150mM精氨酸，0.3～1.5mM二硫代苏糖醇，2～50mM小分子碱，5mM乙二胺四乙酸；/n所述的小分子碱为三乙胺或三乙醇胺；/n所述凝胶柱层析的填料为Sephadex G-100；而且，/n所述重组人源胶原蛋白的纯度达到99%。/n