[发明专利]血清糖化白蛋白检测方法及其专用候选标准物质

摘要

本发明公开了血清糖化白蛋白检测方法及其专用候选标准物质。本发明提供了一种利用同位素稀释液相色谱串联质谱法测定待测样品中糖化白蛋白含量的方法，包括如下步骤A：1)制备标准工作溶液和分离提纯待测样品的白蛋白；2)制备上机标准工作溶液和上机待测样品；3)用液相色谱串联质谱仪对所述上机标准工作溶液和所述上机待测样品分别进行检测，得出所述待测样品中糖化白蛋白含量。本发明的实验证明，本发明在JSCC推荐方法的基础上，应用液相色谱串联三重四级杆质谱建立准确测定糖化白蛋白的候选参考方法。在此基础上，研制冰冻混合人血清基质的GA候选标准物质，拟进一步用于GA项目的室间质量评价及正确度验证。

主权项

1.一种利用同位素稀释液相色谱串联质谱法测定待测样品中糖化白蛋白含量的方法，包括如下步骤A：所述待测样品为血清糖化白蛋白标准品；所述血清糖化白蛋白标准品为糖化白蛋白含量为249.53±13. 29mmol/mol或质量百分含量为14.36%水平1血清样本，糖化白蛋白含量为408.02±11. 70mmol/mol或质量百分含量为22.65%水平2血清样本，糖化白蛋白含量为637.22±17.03mmol/mol或质量百分含量为34.63%水平3血清样本；1）制备标准工作溶液；所述标准工作溶液按照包括如下步骤的方法制备：将赖氨酸、糖化赖氨酸和稳定同位素稀释液按照不同比例混匀，得到各物质不同摩尔比的标准工作溶液；所述稳定同位素稀释液由同位素标记赖氨酸、同位素标记糖化赖氨酸和水组成；2）制备上机标准工作溶液和上机待测样品；将不同的标准工作溶液和所述待测样品的白蛋白均依次进行氢化还原反应、强酸高温水解，得到上机标准工作溶液和上机待测样品；所述待测样品的白蛋白采用SDS‑PAGE电泳分离提纯得到；具体步骤为；a.电泳分离；b.将每个条带置于EP管中碾碎，经体积百分含量为50%乙腈水溶液脱色3遍、体积百分含量100%乙腈脱水后加入质量分数0.25%氨水水溶液溶解白蛋白，超声振荡，所述超声振荡的功率为80%，时间为20分钟，温度为20℃，促进白蛋白溶解，3000g离心2分钟取上清液，置于真空离心浓缩机抽干后获得较纯的白蛋白试料；3）用液相色谱串联质谱仪对所述上机标准工作溶液和所述上机待测样品分别进行检测，得出所述待测样品中糖化白蛋白含量；所述检测采用SRM模式采集碎片离子峰；所述检测中采用的色谱条件如下：色谱柱为C18色谱柱；流动相为如下流动相A和流动相B，采用所述流动相A和所述流动相B进行梯度洗脱；流动相A：水；流动相B：甲醇；所述C18色谱柱为日本岛津LC20AB welch Ultimate AQ‑C18色谱柱，规格为“2.1×250mm，5μm”；所述梯度洗脱为：0‑1min，所述流动相中所述流动相A和所述流动相B的体积比为100：0；1‑3min，所述流动相中所述流动相A和所述流动相B的体积比为20：80；3.1‑8min，所述流动相中所述流动相A和所述流动相B的体积比为100：0；所述检测中采用的质谱条件如下：所述质谱仪为Thermo Fisher TSQ VANTAGE；扫描类型为MS2SRM；离子源为ESI；Ionized Voltage为3998.65V；喷雾气体为氮气；喷雾器压力为30psi；气体流速为10 L/min；API温度200.42℃；扫描范围为300‑2000M/Z。