[发明专利]一种血清胆固醇氧化物的检测方法

摘要

本发明提供一种血清中胆固醇氧化物的检测方法，所述方法包括：样品处理、皂化、固相萃取、硅烷化衍生、HPLC‑MS/MS分析。所述方法能够同时对血清中胆固醇体内自氧化的代表性产物分别进行定量检测，具有良好的应用前景。

主权项

1.一种检测血清中7α‑OH胆固醇、7β‑OH胆固醇、7‑酮基胆固醇、5β,6β‑环氧胆固醇、5α,6α‑环氧胆固醇的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)样品处理：用氯仿‑甲醇萃取血清，吸取氯仿层；(2)皂化：用KOH溶液、无水乙醇、BHT常温震荡皂化，具体包括加入重量/体积为60％的KOH溶液、无水乙醇、BHT常温震荡皂化24h，其中KOH溶液和无水乙醇的加入量均为血清体积的10倍，BHT的终浓度为5‑50ng/mL；(3)固相萃取：皂化后的溶液过SPE固相萃取柱，包括：将皂化后的溶液用乙醚提取3次，再用蒸馏水洗涤2次，无水硫酸钠干燥后30℃旋蒸除去残留的溶剂；加入血清体积5倍的正己烷溶解后，过SPE固相萃取柱，经过体积/体积95:5的正己烷：二乙醚、体积/体积90:10的正己烷：二乙醚、体积/体积80:20的正己烷：二乙醚洗涤后，用体积/体积60:20的丙酮：甲醇洗脱；(4)衍生化：将步骤(3)的产物以Tri‑Sil试剂进行衍生，包括：取固相萃取后的溶液1ml，氮气吹干，加入400μLTri‑Sil试剂，60℃保温45min，旋蒸干燥后加入体积/体积3:1的甲醇：水溶液中；(5)液质联用分析：液相色谱采用RP‑18e阳离子柱，质谱采用API4000三重四极质谱仪；其中，HPLC参数如下：溶液A为体积/体积3:1的甲醇：水，溶液B为异丙醇；0‑0.5min 60％的溶液A、40％的溶液B；0.5‑3.5min线性洗脱，溶液B由40％提高到70％；>3.5min，100％的溶液B；流速为1ml/min；质谱参数为：源温度500℃、雾化电流3μA、气帘气压25psi、雾化气压25psi。