[发明专利]人脐带间充质干细胞提取物冻干粉及制备方法

摘要

本发明涉及人脐带间充质干细胞提取物冻干粉及制备方法，所述的人脐带间充质干细胞提取物冻干粉的制备方法包括以下步骤：使用密度梯度离心法得到纯度较高的人脐带间充质原代干细胞，并将其进行传代培养，收集第3～18代的细胞培养上清液，将上清液与海藻糖混合制成冻干粉。本发明所得的人脐带间充质干细胞提取物冻干粉具有良好的外观性状；将冻干粉进行复溶，溶解较快，溶解完全；动物实验证明其刺激性小，安全性高，使用可靠。此外，本发明所述的冻干粉能有效地保存人脐带间充质干细胞培养上清液的各种具有生物活性的细胞因子，可防御皮肤紫外损伤，促进皮肤胶原蛋白合成，具有美白、延缓衰老的功效。

主权项

1.一种人脐带间充质干细胞提取物冻干粉的制备方法，其特征在于包括以下步骤：(1)干细胞的原代分离、纯化和培养：从新鲜人脐带中分离脐带沃顿胶，消化液消化，用150um细胞过滤器进行过滤，收集滤液，将滤液置于1200r/min条件下离心5min，弃上清，用平衡盐缓冲液洗涤细胞沉淀2～3次，再用2倍体积的平衡盐缓冲液重悬细胞，利用密度梯度离心法纯化细胞悬液，得脐带间充质原代干细胞，将脐带间充质原代干细胞接种于含有100U/ml青霉素和100g/ml链霉素的无血清培养基中进行贴壁培养；(2)干细胞提取物的获取：待脐带间充质原代干细胞接近90％融合，更换新鲜的不含抗生素的无血清培养基，并进行传代培养，收集第3～18代的细胞培养上清液，将上清液用0.22μm的无菌过滤器过滤，取滤液，即得脐带间充质干细胞提取物；(3)干细胞提取物冻干粉的制备：将脐带间充质干细胞提取物与冻干保护剂混匀后，用0.22μm的无菌过滤器过滤除菌，然后使用注射用水调节蛋白浓度至45±0.5μg/ml，冷冻干燥，即得人脐带间充质干细胞提取物冻干粉；所述冻干保护剂为海藻糖，冻干保护剂的用量为5％wt脐带间充质干细胞提取物；所述冷冻干燥具体为：‑80℃超低温冰箱中预冻12h，然后置于真空冷冻干燥机中，‑30℃保持1～2h，在真空度为1.0×10^‑2～1.5×10^‑2mbar，‑5℃条件下冻干10～12h，保持真空度，在20℃继续冻干2～4h，即得；所述步骤(1)中的密度梯度离心法具体为：将细胞悬液缓慢加入到装有等体积分离液的离心管中，4℃，2000r/min离心15～20min，收集中间白膜层，往白膜层中加入等体积的磷酸盐缓冲溶液，4℃，1000r/min离心5～15min，弃上清，再加入等体积的磷酸盐缓冲溶液，4℃，800r/min离心5～15min，弃上清，取沉淀，即得脐带间充质原代干细胞。