[发明专利]一种玉米花药诱导培养方法

摘要

本发明公开一种玉米花药诱导培养方法，包括供体选取小孢子、消毒、冷藏、提取小孢子、黑暗处理、接种、诱导培养等步骤，并对其培养基组分优化。本发明涉及的玉米花药诱导培养方法提高玉米花药愈伤组织分化率、降低白化率，玉米品种京科665、良玉188的愈伤组织诱导率高达71.4％和76.5％，显著提高玉米花药培养效率，具有较高的产业推广前景。

主权项

一种玉米花药诱导培养方法，其特征在于：选取玉米的花药培养供体，正季播种，从大田中选取小孢子发育时期处于四分体时期、单核中期、单核靠边期及双核阶段的花药小穗，取穗后用70％乙醇表面消毒，然后用塑料薄膜包住整个玉米穗，保持玉米穗湿润放入冰箱中，在4℃下低温预处理3天；每个试管接5个穗子，倒入30ml提取液，用高速分散器超速旋切，用300目筛网过滤，滤液离心2～10min，重复3～5次，收集小孢子；小孢子用提取液于25℃、黑暗预处理2d；培养前将小孢子先用20％麦芽糖纯化，再用培养基洗涤1次，然后将小孢子悬浮液接种于培养基中，进行诱导培养，在22～28℃下暗培养2～3天后，环境条件控制为25～29℃、光周期16h7500lx光照8h黑暗；所述提取液的成分为：10～15％甘露醇、1～2g/L CaCl₂、1.2～1.5g/L N‑吗啡乙烷磺酸MES，15～20％蔗糖；其中，所述玉米花药分化培养基的组分为：KNO₃ 3000～3500mg/L，NH₄NO₃ 2500～2800mg/L，KH₂PO₄ 360～400mg/L，CaCl₂·2H₂O 580～640mg/L，MgSO₄·7H₂O 250～300mg/L，Na₂‑EDTA 50～80mg/L，FeSO₄·7H₂O 35～45mg/L，MnSO₄·4H₂O 30～45mg/L，ZnSO₄·7H₂O 15～20mg/L，H₃BO₃ 8.5～10.0mg/L，KI 1.5～2.0mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.05～0.08mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.5～0.8mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.05～0.08mg/L，肌醇30～60mg/L，甘氨酸2.5～3.5mg/L，维生素B1 0.65～0.85mg/L，维生素B6 0.65～0.85mg/L，烟酸0.85～0.90mg/L，蔗糖16～20g/L，琼脂4～5g/L，激动素KT 2.8～3.2mg/L，萘乙酸NAA 0.65～0.85mg/L，山梨醇32～40g/L，生物素0.15～0.20mg/L；吲哚‑3‑乙酸IAA 0～0.55mg/L，甲基茉莉酸0～0.11mg/L，酵母提取物0～4.5mg/L，水杨酸甲酯0～0.35mg/L，2,4‑D 0～10mg/L，复酞核酸0～8.5mg/L。