[发明专利]一种同时检测两种乙肝病毒标志物HBs/HBe的传感器的制备方法及应用

摘要

本发明属于纳米功能材料、免疫分析以及生物传感技术领域，提供了一种同时检测两种乙肝病毒标志物HBs/HBe的传感器的制备方法及应用。分别采用SnO2‑GS@Au@Pt NPs、SnO2‑GS@Ag‑cys‑Au纳米材料作为检测抗体标记物，制备的夹心型电化学免疫传感器实现了对乙肝病毒标志物HBs和HBe的同时检测，具有特异性强，灵敏度高和检出限低等优点，对乙肝病毒标志物HBs/HBe的检测具有重要的科学意义和临床应用价值。

主权项

1.一种同时检测两种乙肝病毒标志物HBs/HBe的传感器的制备方法，其特征在于，步骤如下：（1）将直径为3 ~ 5 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨，超纯水清洗干净；（2）将上述步骤（1）修饰的电极浸入10 mL、质量分数为1% HAuCl4溶液中，在‑0.2 V电压下，电镀30 s，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，晾干；（3）继续将上述步骤（2）修饰的电极浸入乙肝病毒标志物捕获抗体Anti‑HBs和Anti‑HBe浓度分别为8 ~ 12 µg/mL的混合溶液中，4℃冰箱中孵化12 h，取出4℃冰箱中晾干；（4）继续将3 µL，1 ~ 3 mg/mL的BSA溶液滴加到上述步骤（3）修饰的电极表面，用以封闭电极表面上非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；（5）再将上述步骤（4）修饰的电极浸入0.1 pg/mL ~ 50 ng/mL一系列不同浓度的HBs和HBe抗原混合溶液中37℃孵化50 min；室温下晾干，超纯水冲洗，4 ℃冰箱中干燥；（6）最后将上述步骤（5）修饰的电极浸入浓度分别为1 ~ 3 mg/mL的二氧化锡石墨烯负载金杂化铂的HBs检测抗体孵化物溶液SnO2‑GS@Au@Pt NPs‑HBs‑Ab2和二氧化锡石墨烯负载银杂化金的HBe检测抗体孵化物溶液SnO2‑GS@ Ag‑cys‑Au NPs‑HBe‑Ab2的混合液中，室温下孵化50 min，置于4 ℃冰箱中干燥，制得一种同时检测两种乙肝病毒标志物HBs/HBe的传感器；所述检测抗体孵化物溶液SnO2‑GS@Au@Pt NPs‑HBs‑Ab2的制备，其特征在于，步骤如下：(1) Au@Pt NPs制备将1 ~ 3 mL、质量分数为1% HAuCl4溶液加入到100 mL超纯水中，搅拌下快速加入3 ~ 6mL、质量分数为1%的柠檬酸钠溶液，缓慢加入NaBH4至溶液由淡黄色变为红棕色，搅拌过夜；将3~ 7 mL、质量分数为1% 的H2PtCl6溶液加入煮沸的上述HAuCl4溶液中，再加入2 ~ 4 mL、0.1moL/L的抗坏血酸溶液，加热30 min，制得Au@Pt NPs的溶液；(2) SnO2‑GS@ Au@Pt NPs的制备0.1 ~ 0.3 mL、 0.5 mg/mL SnO2‑GS与6 mL上述制备的Au@Pt NPs溶液混合搅拌12 h， 离心分离，洗涤干燥，产物重新分散在超纯水中制成1 ~ 3 mg/mL的SnO2‑GS@ Au@Pt NPs溶液；(3) 检测抗体孵化物溶液SnO2‑GS@ Au@Pt NPs HBs‑Ab2的制备将1 ~ 3 mL、10 μg/mL的HBs 检测抗体Ab2与1 mL、1 ~ 3 mg/mL的SnO2‑GS@ Au@Pt NPs混合4℃震荡孵化过夜，离心洗涤，制得SnO2‑GS@Au@Pt NPs‑HBs‑Ab2检测抗体孵化物；用pH 7.4的PBS缓冲溶液重新分散，制成1 ~ 3 mg/mL的检测抗体孵化物溶液SnO2‑GS@ Au@Pt NPs HBs‑Ab2备用；所述检测抗体孵化物溶液SnO2‑GS@ Ag‑cys‑Au NPs‑HBe‑Ab2的制备，其特征在于，步骤如下：(1) Ag‑cys‑Au 纳米球的制备1) L‑cys@Au NPs的制备在20 ~ 30 mL、2 mmoL/L的L‑半胱氨酸L‑cys溶液中,边搅拌边依次加入250 μL、 0.05moL/L的 HAuCl4溶液，350 μL、 0.01 moL/L的NaBH4, 在300K下搅拌2 h，离心分离，超纯水洗涤，室温下真空干燥12h，制得L‑cys@Au NPs，备用；2) Ag‑cys‑Au纳米球的制备10~ 15 mL、 0.1 mg/mL的L‑cys@Au NPs中，依次加入1 mL，质量分数为1% 聚乙烯吡咯烷酮PVP，1 mL、0.1 moL/L的抗坏血酸，1 mL，0.1 moL/L的 AgNO3溶液，室温下搅拌30~ 40 min，离心分离，超纯水清洗，室温下真空干燥制得Ag‑cys‑Au纳米球；(2) SnO2‑GS@ Ag‑cys‑Au NPs的制备0.1 ~ 0.3 mL、0.5 mg/mL SnO2‑GS与6 mL、1~ 3 mg/mL的Ag‑cys‑Au 纳米球溶液混合搅拌12 h，离心分离，洗涤干燥，产物重新分散在超纯水中制成1 ~ 3 mg/mL的SnO2‑GS@ Ag‑cys‑Au NPs溶液；(3) 检测抗体孵化物溶液SnO2‑GS@ Ag‑cys‑Au NPs‑HBe‑Ab2的制备将1 ~ 3 mL、10 μg/mL的HBe检测抗体Ab2与1 mL、1 ~ 3 mg/mL的SnO2‑GS@ Ag‑cys‑Au NPs混合4℃震荡孵化过夜，离心洗涤；制得SnO2‑GS@ Ag‑cys‑Au NPs‑HBe‑Ab2捕获抗体孵化物；用pH 7.4的PBS缓冲溶液重新分散，制成1 ~ 3 mg/mL的SnO2‑GS@ Ag‑cys‑Au NPs‑HBe‑Ab2检测抗体孵化物溶液备用。