[发明专利]一种高效稳定的果树RNA提取方法

摘要

本发明涉及一种高效稳定的果树RNA提取方法，特别是涉及一种改良的CTAB法提取多年生草本、木本以及藤本果树RNA的方法，经过检验在草莓、苹果、葡萄的组培苗以及大田苗等不同类型果树物种各组织中都可以使用，所提取获得的果树各组织RNA纯度高、效果良好。通过核酸分析发现，本方法可以有效去除果树组织细胞中特有的酚类物质、蛋白质、多糖及小分子盐离子等次生代谢物质，为分子生物学实验中RNA提取制备的良好选择。

主权项

本发明所述的一种高效稳定的果树RNA提取方法，其主要特征在于：A裂解：取待提取RNA的果树试材(除果实外的组织取材约0.5‑1.0g，果实1.5‑2.0g)，置于液氮中迅速研磨成粉末，将1000μl CTAB裂解液和20μlβ‑巯基乙醇依次加入2ml离心管，65℃水浴30min。水浴过程中每隔10min将离心管上下颠倒30次左右，以保证待提取试材与CTAB裂解液充分接触。所述CTAB裂解液母液的配方：①5M NaCl(使用浓度为1.4M)。②0.5M EDTA‑2Na(PH 8.0，使用浓度20mM)。注：磁力搅拌器剧烈搅拌，加入NaOH调PH至8.0溶解。③1M Tris‑HCl(pH 8.0，使用浓度0.1M)，注：用HCl调PH值至8.0。④2％(w/v)CTAB(十六烷基三甲基溴化铵，Cetyltrimethylammonium bromide)。⑤2％(w/v)PVP(聚乙烯吡咯烷酮K‑30，Polyvinylpyrrolidone K‑30)。B抽提：①加入等体积(1000μl)的氯仿∶异戊醇(24∶1)，旋涡混匀；8000g4℃离心10min。②取上清800μl，加入1/2体积的水饱和酚(PH 4.5)，混匀，静置5min后，加入1/2体积氯仿∶异戊醇(24∶1)，旋涡混匀，8000g 4℃离心10min。③取上清600μl(1.5ml离心管操作)，加入1/30体积的NaAc(3M，PH 5.2)和1/10体积的无水乙醇，混匀后静置5min，8000g 4℃离心10min。④取上清450μl，加入1/3体积的LiCl(10M)，‑20℃静置2‑3h，8000g 4℃离心15min；⑤弃上清，用70％的乙醇洗涤沉淀2‑3次，再用无水乙醇洗涤沉淀1次，室温干燥。溶于ddH₂O(RNase free)中，‑70℃保存备用。C检测：①取2μl总RNA，1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。电泳仪电压不宜设置过大(140V为适宜电压)，否则会因产热引起RNA样品降解。②将RNA样品上核酸仪检测，体系为1μl RNA样品加入49μl ddH₂O(RNase free)，RNA浓度、OD280/OD260和OD260/OD230直接从仪器上读取。提取所得RNA OD260/OD280比值正常范围为：1.8‑2.0，比值偏小说明RNA样品中有杂质蛋白污染；比值偏大说明RNA降解严重。苯酚在低pH的情况下可促进水相中的蛋白和DNA向有机相分配，从而最大限度的去除总RNA中的蛋白和DNA，因此在抽提过程中需加入水饱和酚(PH 4.5)。正常提取所得RNA OD260/OD230≥2，若比值偏小或琼脂糖凝胶点样孔模糊，说明所提取的RNA样品中有杂质多糖、多酚或其他盐类小分子物质。