[发明专利]人源干细胞分泌生物活性因子与裂解液的制备方法

摘要

本发明公开了人源干细胞分泌生物活性因子与裂解液的制备方法，干细胞分泌生物活性因子与裂解液来源于脐带组织的干细胞，其内富含干细胞因子群、活性多肽、免疫蛋白和核酸等物质；其包括以下步骤：（1）脐带组织处理；（2）脐带组织干细胞的体外培养、扩增；（3）生物活性因子的制备；（4）裂解液的制备。本发明的生物活性因子或物质中不含任何动物源成分，利用此生物活性因子或物质可开发成具有细胞生物学活性功能的产品，作用于人体后可活化机体干细胞，修复或替代受损、病变和衰老的细胞，具有调节机体细胞代谢功能，增强机体免疫力，延缓衰老等功效。

主权项

人源干细胞分泌生物活性因子与裂解液的制备方法，其特征在于：干细胞分泌生物活性因子与裂解液来源于脐带组织的干细胞， 其内富含干细胞因子群、 活性多肽、免疫蛋白和核酸等物质；其包括以下步骤：（1）脐带组织处理:无菌条件下取足月顺产及剖腹产手术中获得的新鲜脐带1根，剥离脐带外膜，并将脐动脉和静脉去除，充分冲洗后将其剪碎至约1.5mm×1 .5mm×1.5 mm大小组织块，再多次冲洗，至组织块发白放入离心管内；（2）脐带组织干细胞的体外培养、扩增：①将上述剪切后的脐带组织小块种植于加有无血清间充质干细胞培养液的培养皿 ( 直径为100mm) 中，滴入少量体积分数10%血清DMEM培养液，让培养液均匀流散，仅湿润培养皿底部，再用镊子将收集的组织块移入培养皿中，并将组织块均匀平铺于培养皿底，添加少量培养液以保持组织块湿润， 再加入体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液(内含100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素)离心悬浮，将悬浮液用200目不锈钢筛网过滤后保留组织块，收集消化液，然后将消化液接种于无菌培养皿中，在二氧化碳培养箱中培养；②每周半量换液， 培养15天细胞生长约80％汇合， 并收集更换的废培养液于 ‑80℃冰箱中保存 ；③当细胞约 80％汇合时，加入1.25 g/L胰蛋白酶对细胞进行消化20 min， 以 1 ～ 3×10⁵ cells/ml 接种于培养皿中传代培养， 并收集更换的废培养液于 ‑80℃冰箱中保存 ；④当细胞约 80％汇合时， 缓慢加入培养液， 避免组织块浮起， 放入5％二氧化碳培养箱中37 ℃条件下培养，利用1.25 g/L胰蛋白酶对细胞进行消化20 min， 以相差显微镜观察细胞从组织块游出的情况，待细胞密度达到80%后按1∶2的比例传代，收集第 1 代细胞，代后剩下的组织块，再加入培养液，在二氧化碳培养箱中继续培养，每周换液1次，并收集更换的废培养液于 ‑80℃冰箱中保存 ；⑤ 重复步骤④即可；⑥分离、 纯化获得高纯度间充质干细胞， 利用 FACS Calibur 流式细胞仪分析其间充质干细胞纯度；（3）生物活性因子的制备：将步骤（2）脐带干细胞培养、扩增过程中收集的废液融化、混合、 低温分离、 超滤和浓缩；超滤和浓缩的处理方法为：利用3K的超滤膜过滤， 体积浓缩 1/10，保留生物活性物质， 再经截留分子量为 50KD 中空纤维超滤柱超滤， 将超滤后的液体进行浓缩， 即可得到含有丰富干细胞生物活性因子的组合物；（4）裂解液的制备：将体外培养获得的脐带组织干细胞浓度调整为 5×10 ⁶ ～ 1×10 ⁷ 个 / 毫升密封于冻存管中 经超低温液氮反复冻融 5 ～7次至细胞破碎，再通过低温分离、 纯化等现代生物技术手段， 便可获得高纯度的干细胞内生物活性物质群或组合物即为脐带干细胞裂解液。