[发明专利]一种用于预防猪弓形虫病的重组卡介苗及制备方法

摘要

本发明公开了一种用于预防猪弓形虫病的重组卡介苗，本发明还提供了该疫苗的制备方法；利用卡介苗活载体疫苗本身具有较强的细胞免疫和体液免疫佐剂作用的特点，而且能高效表达外源蛋白，使表达的蛋白发挥很好的免疫保护作用，两者优势组合，达到更好的预防弓形虫病的目的。重组BCG集佐剂和载体于一身、兼多种外源基因与活疫苗于一体，一次接种，可获得强而持久的特异性免疫。而且重组BCG稳定且安全性高，运输和保存较为容易。

主权项

穿梭表达载体用于猪弓形虫病预防的重组卡介苗的制备方法，包括以下步骤：根据NCBI上公布的弓形虫Rhomboid基因(Genbank:AY587210)和猪IL‑2基因(Genbank:X58428)的序列及穿梭载体pMV261载体图谱，分别设计引物：猪白介素2(IL‑2)上游引物IL‑F：5'CGGAATTCATGTATAAGATGCAGCTC 3'，其中5’端的酶切位点为EcoRI；下游引物IL‑R：5'CGCGGATCCAGTCAGTGTTGAGTAGATGCTTTG3'，其中5’端的酶切位点为BamHI；弓形虫Rhomboid基因上游引物R‑F: 5'CGCGGATCCATGCCTATTCGCTTTCTCG 3'，其中5’端的酶切位点为BamHI；下游引物R‑R: 5' CCCAAGCTTAATGTAGGACAAATCCCTGTGG 3'，其中5’端的酶切位点为HindIII；PCR分别扩增弓形虫Rhomboid基因及猪IL‑2基因，PCR回收后连入T载体，转入大肠杆菌DH5α感受态中，分别对测序正确的质粒pMD18‑T‑Rho、pMD18‑T‑IL2和pMV261进行双酶切，分别回收两个目的片段和载体片段，将回收的pMV261、IL2及Rhomboid按照1:3:3的比例进行16℃过夜连接，次日转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，培养菌液后提取质粒，分别对重组质粒进行双酶切和PCR鉴定，重组质粒命名为pMV261‑IL2‑Rho；将重组质粒pMV261‑IL2‑Rho电穿孔转化卡介苗中，kan+抗性筛选阳性菌落，并进行传代培养；45℃热诱导目的蛋白表达，对表达产物进行SDS‑PAGE电泳分析及免疫印迹鉴定，命名为rBCG pMV261‑IL2‑Rho。