[发明专利]一种小鼠或大鼠真皮成纤维细胞的分离培养方法

摘要

本发明公开了一种小鼠或大鼠真皮成纤维细胞的分离培养方法，开创性的采用了摇床来洗涤和消化处理后的真皮组织，能有效去除血渍及杂质，组织表面没有表皮残留，内面也没有红色的血丝及脂肪组织的残留，保证了成纤维细胞分离的高纯化度。并且消化得到的成纤维细胞活性高，易贴壁，细胞碎片少，为分离培养成纤维细胞提供了一种新的思路和方法。同时，本发明的原代小鼠或大鼠成纤维细胞的分离培养方法，使用特殊制备的复合酶消化液，并使用4℃条件过夜消化(4‑10h)，相比传统单一的胶原酶预热消化，不但避免了对组织过度消化过度吹打所导致的细胞活性低、得率差的问题，而且消化的更均匀透彻。

主权项

一种小鼠或大鼠真皮成纤维细胞的分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：小鼠或大鼠皮肤组织的提取用剪刀剪取小鼠或者大鼠的皮片，然后去除皮下脂肪及结缔组织，并将皮片剪至大小为4‑5cm²；步骤2：真皮层的剥离以及真皮组织的洗涤将步骤1获得的皮片浸泡在II型Dispase酶中，过夜后撕去表皮，将剩余的真皮组织放入透明袋中，往其中加入PBS溶液，密封后放置在摇床上缓慢摇动洗涤，直至真皮组织变成白色；步骤3：酶消化将步骤2获得的真皮组织放入透明袋中，往其中加入复合酶消化液，密封后放置在摇床上缓慢摇动消化，其中复合酶消化液中包括质量比为1:1:1:1的I型胶原酶、II型胶原酶、IV型胶原酶和Dispase酶；步骤4：分离培养成纤维细胞用含血清的细胞培养基终止步骤3中的消化反应，然后将消化完毕的成纤维细胞过70um筛网，之后加入体积对等的PBS溶液，离心后即得到纯化的小鼠或大鼠真皮成纤维细胞，然后用细胞培养基重悬后放置于37℃，5％CO₂的细胞培养箱中进行培养。